肠道病毒组研究新视角：基于Bulk与VLP宏基因组测序的偏倚分析与互补性探索

这篇综述系统比较了肠道病毒组研究的两种主流测序策略——全宏基因组测序（bulk）和病毒样颗粒富集测序（VLP），揭示了VLP在获得更长、更完整病毒基因组方面的优势，但会改变病毒群落自然结构；而bulk则能更稳定反映病毒-细菌互作。研究通过151例成人及141例婴儿配对样本分析，发现两种方法仅共享约30%病毒基因组，且VLP对革兰氏阳性菌宿主的病毒存在富集偏倚，强调联合使用两种方法对全面解析肠道病毒组至关重要。

　　

VLP显著优于bulk测序：更长、更完整的病毒基因组获取
通过分析151例成人和141例婴儿配对的粪便样本数据，研究发现病毒样颗粒富集测序（VLP）在病毒基因组获取上展现显著优势。VLP生成的病毒操作分类单元（vOTUs）中，48.3%长度超过10kbp，远高于bulk的38.3%。CheckV评估显示，VLP获得的高完整性基因组（>90%完整性）比例更高，且能更敏感地捕获低丰度病毒。然而，两种方法仅共享26.7%（婴儿）和29.3%（成人）的vOTUs，表明VLP获得的较长基因组往往是bulk中短片段的全貌。

VLP显著改变病毒群落结构
Shannon多样性分析揭示，bulk样本呈现更稳定的群落结构，其病毒多样性指数与肠道细菌组显著正相关（成人rho=0.65，婴儿rho=0.48），而VLP样本则无此关联。PERMANOVA分析指出，VLP的群落偏倚主要受宿主特征影响（解释方差4.0%），尤其对革兰氏阳性菌宿主的病毒富集效应显著。例如，感染肠球菌（Enterococcus）和葡萄球菌（Staphylococcus）的噬菌体在VLP中丰度提升2.1-3.8倍，可能与革兰氏阳性菌细胞壁结构更易释放病毒颗粒有关。

高丰度与高流行病毒更易被双方法捕获
比较"仅bulk"、"仅VLP"及重叠vOTUs发现，重叠组的相对丰度中位数显著高于方法特异性组（P<2.2e-16）。值得注意的是，溶原性噬菌体（temperate phage）在两种方法中均比裂解性噬菌体（lytic phage）丰度高1.1-1.4倍，且流行率差异达15.7%。这种生态位分化提示病毒生活方式是影响检测效率的内在因素，与测序策略无关。

细菌宿主特征决定VLP的分类偏倚
在属水平上，LEfSe分析鉴定出65个（婴儿）和98个（成人）差异富集病毒属。其中11个属（如Skunavirus和P68virus）在成人和婴儿中均被VLP富集，其宿主均为革兰氏阳性菌。宿主特征对VLP偏倚的解释度（R²）达4.0%，远超流行率（1.8%）和病毒生活方式（0.9%）的影响。与之相对，bulk对革兰氏阴性菌相关噬菌体（如Salmonella phage）的检出率高出VLP 1.3倍。

方法论启示：互补而非竞争
研究强调两种方法的互补价值：VLP适合获取高质量病毒基因组，而bulk能更好反映病毒-细菌互作网络。例如，在婴儿数据中，VLP漏检了85%的尾病毒目（Caudovirales）成员，而bulk则缺失了72%的未分类噬菌体。这种差异可能源于VLP过滤步骤丢失整合态前噬菌体（prophage），而bulk对游离病毒的低覆盖率（仅占微生物组5.8%）。作者建议未来研究需结合两种策略，并开发校正VLP富集偏倚的生物信息学工具。

技术局限与突破方向
当前VLP流程存在样本需求量大（需≥200mg粪便）、细菌污染风险（约7.5%假阳性）等限制。研究团队通过优化CheckV过滤（≥50%完整性）证实，VLP在严格质控下仍保持更优的基因组质量。值得注意的是，使用三代测序（如Nanopore）可能缓解bulk的基因组碎片化问题，但尚未在病毒组研究中系统评估。这些发现为肠道病毒组的标准化研究提供了重要方法论框架。