新型荧光标记口腔链球菌株的设计开发及其在微生物生态学研究中的应用

（编辑推荐）本研究通过染色体整合技术成功构建了表达mTagBFP2、sfGFP和mScarlet-I3荧光蛋白的口腔链球菌工程菌株（S. mutans/S. gordonii/S. sanguinis），证实其在单细胞分析、多物种生物膜成像及唾液环境适应性研究中的价值。该成果为口腔微生物互作（interspecies interactions）、生物膜基质（EPS）可视化及龋病相关研究提供了关键工具。

　　

研究背景与技术突破

口腔链球菌作为口腔软硬组织早期定植者，与龋病（dental caries）、牙髓感染（endodontic infections）和牙周病（periodontal disease）密切相关。传统荧光标记技术存在信号不稳定、光谱重叠等问题。本研究创新性地采用合成生物学策略，将优化后的蓝色荧光蛋白mTagBFP2、绿色荧光蛋白sfGFP和红色荧光蛋白mScarlet-I3通过P_veg启动子驱动，整合至链球菌染色体转录沉默区（SMU.1155/SGO_2075/SSA_2030），避免了质粒不稳定性对实验的干扰。

菌株构建与功能验证

通过RNA-Seq筛选低转录活性区域，插入含荧光基因（codon-optimized for S. mutans）、壮观霉素抗性基因（aad9）及强终止子L3S2P21的合成片段。生长曲线和竞争指数（competitive index）实验显示，工程菌株在TYG培养基中与野生型相比无显著适应性差异（P>0.05）。值得注意的是，S. sanguinis的sfGFP株因蛋白成熟障碍未检测到信号，而mTagBFP2和mScarlet-I3信号延迟至15-18小时才显现，提示物种特异性表达差异。

荧光特性与成像应用

宽场显微镜和超分辨共聚焦成像（super-resolution confocal microscopy）证实：

1. 光谱特异性：S. mutans和S. gordonii三色菌株在DAPI（399/454 nm）、FITC（485/528 nm）和Texas Red（550/590 nm）通道均显示强特异性信号，而S. sanguinis存在FITC通道交叉信号；
2. 生物膜解析：三菌共培养（triculture）中可清晰区分微菌落空间分布，并量化胞外聚合物（EPS）占比（如S. mutans微菌落含58%菌体+14%葡聚糖+7% eDNA）；
3. 唾液效应：添加50%人唾液（TYG-Saliva）导致S. sanguinis和S. mutans的SYTOX染色阳性率升至99%和83%（vs S. gordonii仅34%），揭示物种特异性膜完整性损伤。

技术局限与未来方向

研究指出远红色荧光蛋白mMaroon1在所有测试菌株中均无信号，而染色体整合位点的菌株特异性（如SMU.1155仅存于3.5% S. mutans基因组）限制了普适性。建议未来优化密码子使用（如针对S. sanguinis）并开发更广谱的整合位点。

方法论创新

首次实现：

• 基于AI细胞分割（NIS-Elements GA3）的单菌膜完整性定量；
• 同步可视化生物膜三维结构中菌体、葡聚糖（Alexa647-dextran标记）和eDNA（抗dsDNA抗体）的空间关联；
• 无需固定处理的活菌动态观测技术，为口腔微生物生态学研究提供了高分辨率工具集。

（注：全文数据来源于Bioscreen C生长分析仪、Agilent Biotek Lionheart FX和Nikon A1R共聚焦平台，实验重复≥3次）