结核分枝杆菌分泌毒力因子Rv1435c/hsr1破坏宿主snRNP生物发生调控RNA剪接的分子机制

本研究揭示了结核分枝杆菌（Mtb）通过分泌毒力因子Rv1435c/hsr1靶向干扰宿主剪接体小核核糖核蛋白（snRNP）生物发生的新机制。该蛋白通过ESX-1分泌系统进入宿主细胞质，特异性结合U5 snRNA和剪接体核心蛋白SNRPF，导致关键外显子跳跃事件（exon-skipping），从而抑制宿主抗菌反应。遗传缺失实验证实hsr1是决定Mtb在巨噬细胞和小鼠模型中存活的关键毒力因子，人类结核肉芽肿组织也呈现SNRPF异常定位。该发现为抗结核治疗提供了以宿主剪接调控（RNA splicing）和病原体分泌系统为靶点的新策略。

　　

结核分枝杆菌通过hsr1破坏宿主RNA剪接的分子机制

Significance
病原体通过劫持宿主生理过程实现感染致病。结核分枝杆菌（Mtb）作为人类结核病（TB）的病原体，已知能调控多种宿主抗菌功能。本研究发现Mtb通过分泌蛋白Rv1435c/hsr1特异性改变宿主RNA剪接过程。RNA剪接是真核生物基因表达的核心环节，剪接异常可导致蛋白质功能缺陷。研究表明，hsr1通过干扰剪接体分子机器组装发挥作用，其缺失会显著影响Mtb在巨噬细胞和动物模型中的生存能力。这种调控宿主RNA剪接的能力可能是致病性Mtb进化过程中的关键适应性特征。

Abstract
转录适应驱动宿主对Mtb感染的反应，但Mtb通过改变宿主RNA剪接抑制抗菌反应的机制尚不明确。本研究通过高通量酵母双杂交（Y2H）筛选发现多个Mtb分泌蛋白与宿主剪接因子（SFs）相互作用。其中Rv1435c/hsr1能特异性诱导外显子跳跃事件，促进Mtb吞噬体与U5 snRNA及SNRPF（snRNP关键组分）的直接结合。遗传缺失hsr1可逆转野生型Mtb诱导的特异性剪接改变。Δhsr1菌株在巨噬细胞离体感染和小鼠体内感染中均表现生长缺陷。人类肠结核（ITB）活检组织中也观察到hsr1依赖的SNRPF异常定位现象，证实hsr1是通过破坏snRNP生物发生发挥致病作用的毒力因子。

Dysregulated Spliceosome Complex Composition in Mtb-Infected Macrophages
前期研究发现Mtb感染巨噬细胞会导致靶基因外显子跳跃，产生缺乏功能域的非功能性转录本。对感染细胞中剪接体复合物的质谱分析显示，包括SNRNP、HNRNP在内的多种剪接相关蛋白出现核质分布异常。其中U2/U5.U6三聚体复合物组分SNRPF的核池显著减少，提示snRNP生物发生过程可能被Mtb靶向干扰。

Identification of Mtb Proteins Interacting with Host Spliceosome Components
构建包含384个Mtb分泌蛋白（BD载体）与162个人类剪接因子（AD载体）的Y2H文库，筛选获得117个Mtb蛋白与54个宿主SF的互作网络。重点验证了Rv1435c/hsr1与GEMIN3（DDX20）、PRPF18的相互作用，并通过哺乳动物细胞Co-IP实验确认其结合特异性。值得注意的是，截短型SF异构体比全长蛋白表现出更广泛的Mtb蛋白结合能力，暗示感染可能影响宿主蛋白稳态。

Mtb hsr1 Sequesters U5 snRNA and SNRPF in Cytosol
snRNP生物发生需经历snRNA的核质穿梭过程。RNA荧光原位杂交（FISH）显示Mtb感染48小时后，U5 snRNA在胞质中异常累积并与细菌吞噬体共定位。这种相互作用具有hsr1依赖性：Δhsr1菌株感染的巨噬细胞中U5 snRNA-吞噬体结合减少60%，而回补株Δhsr1::WT可部分恢复表型。共聚焦显微镜与免疫共沉淀证实hsr1直接结合sm核心蛋白SNRPF，导致其在胞质中被异常扣押。

ESX1-Dependent Secretion Mechanism
hsr1的分泌依赖ESX-1型分泌系统：ΔesxA/B（缺失ESAT6/CFP10）菌株无法将hsr1递送至宿主胞质，其诱导的外显子跳跃事件（如ACADVL exon3跳过）强度仅为野生型的30%。结构预测显示hsr1具有N端信号肽，但实验证实其跨膜转运需要ESX-1系统形成吞噬体膜孔道。

Virulence Role in Infection Models
功能实验表明hsr1是Mtb的关键毒力决定簇：

1. 在THP-1巨噬细胞中，Δhsr1菌株的CFU较野生型降低2.5倍
2. 过表达SNRPF可逆转野生型Mtb的感染优势
3. 小鼠感染4周后，Δhsr1菌株肺载量下降80%
4. 人类ITB肉芽肿中可见SNRPF在巨细胞胞质异常富集

Implications for TB Pathogenesis
该研究阐明Mtb通过"胞质拦截"策略破坏snRNP生物发生的独特机制：
• 时空特异性：hsr1在感染后期（48hpi）显著上调U5 snRNA结合
• 靶向精确性：选择性影响ACADVL、DDX11等抗菌相关基因的剪接
• 进化关联性：hsr1在致病性分枝杆菌中演化为非酶类效应蛋白
临床意义在于揭示宿主剪接机器（如SNRPF）与病原体分泌系统（如ESX-1）可作为抗结核治疗的"双靶点"。对20例肺结核患者单核细胞的RNA-seq分析显示，剪接紊乱特征可显著区分活动性TB与健康对照，为诊断生物标志物开发提供新思路。

技术亮点

1. 定制化剪接报告系统pGint实现外显子跳跃事件定量
2. 三维重构技术精确定位U5 snRNA-吞噬体相互作用界面
3. 交叉验证策略（Y2H→Co-IP→遗传缺失→临床样本）
   未解问题
   • 其他互作Mtb蛋白（如Rv1566c）的协同效应
   • hsr1是否影响snRNA的Sm环组装过程
   • 剪接紊乱与TB慢性化的因果关系

这项研究为理解复杂宿主-病原体互作提供了范式：病原体可通过靶向基础生命过程（如RNA加工）的保守质量控制机制，实现对宿主的精准调控。