串联剪接受体位点(NAGNnAG)变异与人类疾病的关联性研究及临床解读新策略

本研究针对基因组医学中NAGNnAG变异（串联剪接受体位点）的临床解读难题，通过分析GRCh37基因组±30bp范围内的二核苷酸AG位点变异，结合ClinVar、gnomAD数据库及779例未确诊疾病患者(UDP)数据，首次系统评估了该类变异与疾病的关联性。研究通过RNAseq实证验证了-21至+30区域新型受体的功能性，发现SpliceAI预测模型存在局限性，为临床变异解读提供了必须依赖实验验证的重要依据。

　　

在基因组医学时代，约30%的致病性变异涉及pre-mRNA剪接异常，其中串联剪接受体位点(NAGN_nAG)变异因其特殊的"双AG"结构成为临床解读的灰色地带。这类变异可能通过创建或破坏受体位点影响剪接，但现有生物信息工具如SpliceAI对其预测准确性存疑，导致临床实验室常将其归类为"意义未明变异(VUS)"。更棘手的是，人类基因组中天然存在大量NAGN_nAG序列，如何区分致病性与良性变异直接关系到数百万患者的精准诊疗。

为破解这一难题，美国国立卫生研究院未确诊疾病项目(UDP)的研究团队在《Genetics in Medicine》发表了里程碑式研究。该工作首次系统分析了GRCh37参考基因组±30bp窗口内的二核苷酸AG变异特征，整合ClinVar致病性变异库与gnomAD人群频率数据库进行流行病学对比，并创新性地对107例UDP患者开展RNAseq功能验证。通过多维度数据交叉验证，研究者绘制出NAGN_{nAG变异的致病风险图谱，为临床实践提供了循证依据。}

关键技术方法包括：1) 基于GRCh37基因组坐标的AG位点系统注释；2) ClinVar与gnomAD数据库的变异频率对比分析；3) 779例UDP患者队列的基因组-表型关联研究；4) 107例患者的RNAseq剪接定量分析；5) SpliceAI预测效能评估。

【结果】
◆ Purpose：揭示NAGN_nAG变异在±30bp范围内对剪接调控的影响程度，建立其与人类疾病的关联证据链。
◆ Methods：通过计算生物学发现自然剪接受体附近30bp内的NAGN_nAG变异在ClinVar中的富集程度显著高于gnomAD（p<0.001），但两个数据库的变异在SpliceAI评分上无显著差异，提示纯计算预测存在盲区。
◆ Results：RNAseq实证显示-21至+30区域均可产生新型功能性剪接受体，且变异致病性无明确位置偏好性。约38%的临床报告致病性变异经实验验证确实导致异常剪接，但SpliceAI评分未能有效区分致病/良性变异（AUC=0.62）。
◆ Conclusion：首次证明NAGN_nAG变异具有"位置不敏感但功能显著"的特性，其临床解读必须结合实验数据，仅依赖生物信息预测可能导致误判。

这项研究颠覆了传统认知：1) 扩展了功能性剪接受体的有效作用范围（突破常规-3至+6区域）；2) 揭示SpliceAI等工具对复杂剪接变异的预测局限性；3) 建立RNA分析作为NAGN_nAG变异分类的金标准。这些发现为修订ACMG变异解读指南提供了关键证据，推动基因组医学从"预测主导"向"实验验证优先"的范式转变。特别值得注意的是，研究中约22%的临床意义变异位于传统认为的"非敏感区"，这一发现将直接影响临床实验室对剪接变异注释的覆盖范围设定。未来需开发整合实验数据的多模态预测模型，以应对复杂剪接变异解读的挑战。