基于β-烟酰胺单核苷酸(NMN)负载的脐带间充质干细胞小细胞外囊泡通过激活NAD+/SIRT3信号通路介导的线粒体自噬延缓皮肤衰老的研究

本研究针对皮肤衰老治疗中β-烟酰胺单核苷酸(NMN)水溶性高、渗透性差的问题，创新性地采用电穿孔技术构建NMN负载的人脐带间充质干细胞小细胞外囊泡(NMN-sEVs)。通过D-半乳糖诱导的小鼠皮肤衰老模型，发现NMN-sEVs能显著改善皮肤衰老表型，其机制是通过提升细胞内NAD+水平和SIRT3表达，激活线粒体自噬通路，从而逆转衰老相关的线粒体功能障碍。该研究为抗衰老药物开发提供了新策略。

　　

随着人口老龄化加剧，皮肤衰老已成为备受关注的健康问题。皮肤作为人体最大的器官，其衰老不仅影响外观，更与多种年龄相关疾病密切相关。目前研究发现，衰老皮肤会通过分泌衰老相关分泌表型(SASP)影响全身器官功能，而线粒体功能障碍是细胞衰老的关键特征。然而，现有抗衰老药物如β-烟酰胺单核苷酸(NMN)虽能提高NAD+水平改善线粒体功能，却因高水溶性和低渗透性限制了临床应用。这一瓶颈问题亟待突破性解决方案。

江苏大学附属医院和江苏大学医学院的研究团队在《Stem Cell Research》发表了一项创新性研究。他们采用电穿孔技术将NMN装载到人脐带间充质干细胞(hucMSC)来源的小细胞外囊泡(sEVs)中，构建了NMN-sEVs给药系统。通过D-半乳糖诱导的小鼠皮肤衰老模型和原代皮肤成纤维细胞实验，结合纳米微针透皮给药技术，系统评估了NMN-sEVs的抗衰老效果及其分子机制。

研究采用了多项关键技术：1) 电穿孔技术构建NMN-sEVs并检测载药效率；2) 纳米微针透皮给药系统优化；3) D-半乳糖诱导的皮肤衰老动物模型；4) 线粒体功能检测(膜电位、ROS、形态学分析)；5) 线粒体自噬相关蛋白表达分析；6) SIRT3特异性抑制剂3-TYP干预实验。

【Nano-microneedles有效促进sEVs进入皮肤深层并预防小鼠皮肤衰老】
研究首先优化了给药方式，比较了局部涂抹和纳米微针两种方法。透射电镜和纳米颗粒追踪分析证实成功分离出典型杯状结构的hucMSC-sEVs，粒径约124.2nm。纳米微针能穿透表皮接近真皮，显著提高sEVs的皮肤渗透性。在D-半乳糖诱导的衰老小鼠中，纳米微针给药的sEVs能更好改善表皮变薄、胶原纤维紊乱等衰老表型。

【NMN负载的hucMSC-sEVs有效延缓小鼠皮肤衰老】
通过高效液相色谱(HPLC)测定，电穿孔构建的NMN-sEVs载药效率达44.13%，载药量达4424.57μg/10¹⁰ sEVs。动物实验显示，NMN-sEVs处理显著改善皮肤皱纹，增加表皮厚度和胶原纤维比例，降低衰老标志物P21、P53表达，提升增殖指标Ki67和PCNA水平。

【NMN负载的hucMSC-sEVs有效防御皮肤成纤维细胞衰老】
在原代皮肤成纤维细胞(DFs)模型中，DiL标记证实NMN-sEVs能被细胞高效摄取。NMN-sEVs处理显著降低D-半乳糖诱导的β-半乳糖苷酶活性和ROS水平，上调胶原蛋白CoL1A1表达，下调衰老相关因子IL-6、IL-8和Tgf-β。

【NMN负载的hucMSC-sEVs通过促进线粒体自噬改善细胞衰老】
透射电镜显示衰老细胞线粒体嵴结构模糊消失，而NMN-sEVs处理组线粒体形态改善并出现自噬现象。Mitotracker和JC-1染色证实NMN-sEVs能恢复线粒体膜电位，降低线粒体ROS。免疫荧光显示NMN-sEVs促进线粒体与LC3B及溶酶体标志物LAMP1的共定位，表明激活了线粒体自噬。

【NMN负载的hucMSC-sEVs通过调节NAD+/SIRT3通路介导的线粒体自噬延缓成纤维细胞衰老】
分子对接证实NAD+与SIRT3存在相互作用。NMN-sEVs处理显著提升细胞内NAD+水平和SIRT3表达，上调线粒体自噬相关蛋白Parkin、PINK1和LC3II/I。使用SIRT3抑制剂3-TYP处理后，NMN-sEVs对细胞衰老、线粒体功能和自噬的改善作用被显著抑制。

研究结论表明，NMN-sEVs能通过激活NAD+/SIRT3信号通路促进线粒体自噬，有效逆转衰老相关的线粒体功能障碍。这一发现不仅阐明了皮肤衰老的新机制，更为抗衰老药物开发提供了创新思路——将干细胞来源的sEVs作为纳米药物载体，克服了传统抗衰老药物的递送瓶颈。该研究的临床转化潜力巨大，有望为皮肤衰老及相关系统性衰老疾病的治疗开辟新途径。