放疗联合Robo1 CAR-NK92细胞治疗：协同增效对抗实体瘤的新策略

本研究针对CAR-NK细胞在实体瘤治疗中因肿瘤微环境(TME)抑制导致的疗效受限问题，通过开发靶向Robo1的CAR-NK92细胞系，结合放疗调控TME的独特优势，证实了二者联用可显著增强肿瘤细胞杀伤效果。实验显示放疗通过上调NKG2D配体表达和促进CAR-NK细胞迁移，使KYSE30食管癌和A549肺癌小鼠模型生存期显著延长，为实体瘤联合治疗提供了新思路。

　　

实体瘤治疗领域长期面临免疫细胞浸润不足和免疫抑制微环境的双重挑战。尽管嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞疗法在血液肿瘤中成效显著，但其在实体瘤中的应用仍受限于细胞因子释放综合征等副作用。自然杀伤细胞(NK)因其无需抗原预致敏且安全性高的特点成为理想替代，但CAR-NK细胞同样遭遇肿瘤微环境(TME)的"铜墙铁壁"——缺氧、酸性pH、免疫抑制性细胞和因子共同构筑的屏障严重阻碍其疗效。

山东第一医科大学附属肿瘤医院联合苏州艾斯凯普技术团队另辟蹊径，选择在多种实体瘤中特异性高表达而在正常组织几乎不表达的Roundabout guidance receptor 1(Robo1)作为靶点，构建了包含CD8铰链区、4-1BB共刺激域的Robo1 CAR-NK92细胞系。该研究创新性地将放疗这一传统手段与前沿细胞疗法结合，基于放疗可重塑TME、增强免疫细胞浸润的特性，在《Journal of Translational Medicine》发表的研究中揭示了"放疗+CAR-NK"的协同机制。

关键技术方法包括：通过三质粒系统构建Robo1 CAR慢病毒并转导NK92细胞；采用CCK-8法和ELISA检测放疗前后细胞毒性及细胞因子分泌；qPCR和Western blot分析NKG2D配体及Robo1表达；Transwell实验评估细胞迁移能力；建立KYSE30和A549裸鼠移植瘤模型验证联合疗效。

研究结果
Robo1 CAR-NK92细胞的构建与验证
成功构建的CAR结构包含Robo1单链抗体(scFv)和CD3ζ/4-1BB信号域，流式检测显示转导效率达95.7%。该细胞对Robo1高表达的A549(89.1%)和KYSE30(65.8%)细胞具有特异性杀伤，而对低表达的HCT116(11.8%)无效，且伴随IFN-γ、颗粒酶B(Granzyme B)和TNF-α分泌增加。

放疗增强CAR-NK92细胞毒性
10 Gy照射使A549和KYSE30细胞的杀伤率显著提升，但HCT116无变化。关键发现是放疗虽未改变Robo1蛋白水平，却通过qPCR检测到NKG2D配体ULBP1-3和MICA/B mRNA表达上调2-5倍。NKG2D中和抗体实验证实该通路贡献了约50%的增效作用。

放疗促进CAR-NK92细胞迁移
照射后肿瘤细胞分泌的CXCL9/10/16等趋化因子增加5倍以上，Transwell实验显示A549和KYSE30条件培养基使CAR-NK92迁移量提升3倍，与ELISA检测的蛋白水平变化一致。

体内协同抗肿瘤效应
在皮下移植瘤模型中，放疗联合治疗组小鼠生存期较单用组显著延长（p<0.01），肿瘤体积缩小60%。免疫组化证实放疗未引起Robo1抗原丢失，流式检测显示联合组肿瘤内CAR-NK细胞浸润增加2倍，且血清IL-6/IL-2未检出，安全性良好。

结论与意义
该研究首次阐明放疗通过双重机制增强CAR-NK疗效：一方面通过NKG2D配体上调激活固有杀伤途径，另一方面通过趋化因子网络促进细胞浸润。这种"放疗破壁，CAR-NK攻坚"的策略，不仅克服了实体瘤物理屏障和免疫抑制的双重阻力，更避免了靶标抗原丢失风险。研究为临床转化提供了重要依据：放疗剂量（10 Gy）与细胞输注时机（24小时后）的优化方案，以及Robo1作为实体瘤广谱靶点的可行性验证。未来或可拓展至肝癌、胃癌等Robo1高表达瘤种，并与免疫检查点抑制剂形成三联方案，有望突破当前实体瘤免疫治疗的瓶颈。