人血清白蛋白广泛瓜氨酸化是生理现象且与类风湿关节炎免疫原性无关

本研究揭示了人血清白蛋白(HSA)在健康人群和类风湿关节炎(RA)患者中均存在11个精氨酸位点的广泛瓜氨酸化，且修饰程度相似。通过质谱分析和ELISA实验，研究人员发现RA患者对生理性瓜氨酸化白蛋白的免疫反应与健康对照无显著差异，表明该修饰是生理过程而非RA特异性免疫靶点。研究还证实PAD2/PAD4酶和中性粒细胞可催化白蛋白瓜氨酸化，并发现该修饰会降低甲状腺素结合能力。这一发现为理解RA中瓜氨酸化蛋白的免疫耐受机制提供了新视角。

　　

在类风湿关节炎(RA)的诊断标志物中，抗瓜氨酸化蛋白抗体(ACPA)具有高度特异性，但其靶抗原的筛选一直存在争议。过去认为瓜氨酸化修饰是RA特有的病理特征，然而越来越多的证据显示，健康人体内也存在蛋白瓜氨酸化现象。这种修饰由蛋白精氨酸脱亚胺酶(PAD)催化，将带正电荷的精氨酸(Arg)转化为中性瓜氨酸(Cit)，可能改变蛋白质结构和功能。作为人体最丰富的血浆蛋白，人血清白蛋白(HSA)占滑液重量的56%，其瓜氨酸化的生理意义和潜在免疫原性亟待阐明。

华盛顿大学的研究团队通过质谱(LC-MS/MS)分析了86例RA患者、24例系统性红斑狼疮(SLE)患者和33名健康对照的血清样本，结合体外酶促反应和功能实验，系统研究了HSA瓜氨酸化的特征及其免疫学意义。研究采用的主要技术包括：基于Orbitrap Exploris 480的定量质谱分析、抗修饰瓜氨酸(AMC)免疫印迹验证、中性粒细胞体外催化实验，以及针对14个瓜氨酸化位点的肽段ELISA检测。样本来源于大学风湿病生物样本库，包含血清和滑膜液。

RA患者和CCP状态
研究队列包含86例典型RA患者，59.5%为CCP阳性。质谱分析显示，CCP阳性和阴性患者的白蛋白瓜氨酸化模式无显著差异，提示ACPA状态不影响HSA修饰水平。

白蛋白中瓜氨酸化Arg位点的鉴定
在585个氨基酸的HSA中鉴定出11个保守的瓜氨酸化位点(R81、R98、R117、R222、R257、R428、R445、R472、R484、R485、R521)，主要位于配体结合口袋附近。令人意外的是，健康对照与RA患者的修饰位点高度重叠，仅R445、R472、R521在部分RA样本中零星出现。

RA和健康供体中白蛋白瓜氨酸化的化学计量
定量分析显示R98修饰程度最高(健康组17.51±7.81%，RA组19.07±8.34%)，其次是R485和R257。总体瓜氨酸化水平在健康组(1.22±0.27%)与RA组(1.30±0.46%)间无统计学差异。滑膜液中R81、R98、R484修饰略有增加，而R257减少，但样本量限制使差异未达显著性。

白蛋白中瓜氨酸化Arg残基的位置
晶体结构分析(PDB:1AO6)显示，修饰位点多位于蛋白表面或配体结合口袋边缘。值得注意的是，高修饰位点R98的溶剂可及表面积(SAAS)仅18.65?²，而最大可及位点R114(185.13?²)却未被修饰，提示HSA构象动态变化影响PAD可及性。多个位点(R81、R114、R428、R521)邻近新生儿Fc受体(FcRn)结合界面，可能影响蛋白循环半衰期。

PAD2、PAD4和活中性粒细胞对白蛋白的瓜氨酸化
体外实验证实，重组PAD2偏好修饰R98和R472，而PAD4特异性靶向R81(修饰率达89.34%)。中性粒细胞催化的修饰谱与单一PAD酶不同，显示其表面PAD4和分泌型PAD2的协同作用。

体外瓜氨酸化白蛋白结合甲状腺素减少
PAD4处理使HSA的甲状腺素(T4)结合能力下降至36.3%，证实瓜氨酸化可改变其运输功能。

针对白蛋白单个瓜氨酸化位点的IgG ACPA反应
ELISA检测发现，仅1例RA血清对完整瓜氨酸化HSA有强反应，且该样本对所有修饰肽段均无特异性。虽然60.5%RA血清对某些Cit肽段有反应，但健康组也存在类似比例(32.6%RA样本超过健康组95%百分位值)。值得注意的是，RA组对R114/117、R428、R484/485肽段的反应反而显著低于健康对照。

这项研究颠覆了传统认知，证实HSA瓜氨酸化是生理现象而非RA特异性事件。修饰位点在健康人和患者中的高度保守性，以及缺乏特异性ACPA反应，支持"生理性瓜氨酸化维持免疫耐受"的假说。研究还揭示了PAD2/PAD4的催化特性差异，以及瓜氨酸化可能通过影响FcRn结合或配体运输发挥生理功能。特别重要的是，发现甲氨蝶呤使用者的血清对R218/R222肽段反应与药物剂量负相关，提示修饰可能影响药物动力学。这些发现为理解RA中ACPA的产生机制提供了新框架——真正的致病性ACPA可能针对非生理性瓜氨酸化表位，而生理性修饰因中枢耐受机制不被识别。该研究也为开发针对PAD特异性或FcRn互作的干预策略提供了理论依据。