基于新型醇醛转化系统重构代谢网络提升Komagataella phaffii甲醇利用效率的研究

本研究针对微生物甲醇利用效率低下的瓶颈问题，通过构建基于Adh900蛋白的新型醇醛转化系统，结合组氨酸代谢调控与启动子优化策略，使Komagataella phaffii的细胞干重(DCW)提升63%至4.33 g/L，为甲醇生物制造技术发展提供了创新性解决方案。

　　

随着全球碳中和发展战略的推进，甲醇作为可再生的单碳原料（C1），通过CO₂催化转化获得，成为替代糖类的绿色生物制造底物。然而，天然甲基营养菌如Komagataella phaffii（原Pichia pastoris）虽具备甲醇利用途径（MUTP），其低效的木酮糖单磷酸途径（XuMP）和甲醛毒性问题导致能量代谢失衡——生长相关维持能（GAME）激增140%，而细胞干重（DCW）仅为葡萄糖培养的50%。这种"代谢超载"现象严重制约了甲醇生物制造在脂肪酸、萜类等高值化合物合成中的应用，例如相同条件下甲醇源苹果酸产量（2.7 g/L）不足葡萄糖源（8.7 g/L）的三分之一。

中国轻工业技术与工程一流学科团队通过系统解析K. phaffii的甲醇代谢网络，创新性地引入内源性Adh900蛋白构建醇醛转化系统。该蛋白虽在乙醇代谢中活性低于Adh2，却能特异性提升甲醇-甲醛转化效率，使菌株生物量增加14%。研究进一步发现组氨酸在XuMP途径中的关键作用：补充120 mg/L组氨酸可显著缓解甲醛压力，结合TEF1启动子优化策略，最终实现DCW 4.33 g/L的突破性提升，较野生型提高63%。

关键技术包括：1）基于Adh900的代谢网络重构；2）组氨酸剂量效应实验；3）多启动子（如GAP、TEF1）表达系统优化；4）代谢流分析（MFA）评估XuMP通量。

【Profiling of methanol utilization pathway】
研究团队首先绘制了K. phaffii的甲醇代谢图谱（图1A），发现XuMP途径中Aox1/2（醇氧化酶）、Das1/2（二羟基丙酮合酶）等8种酶催化的单向反应形成代谢瓶颈。通过引入Adh900系统，成功将甲醛转化效率提升1.8倍，同时降低胞内活性氧（ROS）积累40%。

【Conclusion】
该研究首次证实内源性醇醛转化系统与组氨酸的协同效应：Adh900通过NAD⁺依赖途径加速甲醇脱氢，而组氨酸作为甲醛捕获剂促进XuMP通量。启动子工程使关键酶表达量提升3.2倍，最终菌株在甲醇培养基中的碳转化率达到0.38 g DCW/g CH₃OH，为甲醇生物制造提供了"代谢分流-毒性缓解"的双重解决方案。

这项发表于《Journal of Biotechnology》的研究，不仅为C1生物经济提供了高效细胞工厂构建范式，其揭示的组氨酸-甲醛互作机制，对指导其他甲基营养菌（如Bacillus methanolicus）的代谢改造具有普适意义。研究获得国家自然科学基金（32270054）等支持，相关技术已应用于萜类化合物生物合成领域。