变形菌胆汁酸醛缩酶CtSal的催化机制解析：硫解酶关键残基在C5类固醇侧链逆醛醇裂解中的功能重塑

本研究解析了变形菌来源的胆汁酸醛缩酶CtSal与CtShyDUF35复合物的1.95 ?晶体结构，揭示其通过独特的Tyr302-Cys304催化双元体系实现C5类固醇侧链特异性裂解，提出原虫SCP-2样蛋白可能具有醛缩酶功能的新观点，为设计类固醇药物生物催化剂提供新思路。

　　

研究背景
类固醇化合物作为第二大类治疗药物，其传统化学合成面临步骤繁琐、立体选择性差等挑战。微生物酶因其高效特异性成为绿色合成的突破口，但类固醇分子稠环结构的顽固性和侧链多样性使得降解酶机制研究尤为关键。在变形菌的胆汁酸降解途径中，醛缩酶Sal负责C₅侧链的逆醛醇裂解，然而其结构基础与催化机制长期未明，更与同源蛋白Ltp2（靶向C₃侧链）的进化关系存在争议。

研究方法
加拿大研究团队通过X射线晶体学解析CtShy_DUF35-CtSal复合物结构（1.95 ?），结合AlphaFold3建模和定点突变验证催化残基。采用稳态动力学分析5种胆汁酸衍生物底物特异性，利用LC-MS/MS和竞争实验验证代谢通量。通过系统发育分析明确Sal/Ltp2/SCP-2蛋白的进化分支。

研究结果
1. CtSal偏好胆汁酸而非胆固醇衍生物
动力学分析显示CtSal对cholyl-22-OH-CoA等四种胆汁酸（k_cat/K_m≈10⁶ M^-1s^-1）的催化效率比胆固醇代谢物高260倍，暗示其活性口袋对A环弯曲构象的特异性识别。

2. αββα异源四聚体结构特征
晶体结构揭示中央CtSal二聚体（硫解酶折叠）两侧各结合一个CtShy_DUF35结构域。独特的Cys₃His₁锌指通过β2-α2环重塑底物结合裂隙，空间位阻排斥平面胆固醇环而容纳弯曲胆汁酸环。

3. Tyr302-Cys304催化双元体系
Y302F和C304A突变使酶活完全丧失，结合底物对接模型提出：Tyr302作为碱夺取C22-OH质子引发C-C键断裂，Cys304作为酸向CoA烯醇化物供质子，Gln161/Gly391构成氧阴离子穴。该机制区别于Ltp2的Tyr294/Tyr344催化对。

4. 动态底物结合口袋
β4-α4环（残基127-135）的构象无序性通过AF3预测为α螺旋，这种"无序-有序"转变赋予容纳大分子底物的结构可塑性。

5. 进化与功能重定位
系统发育表明Sal/Ltp2/SCP-2形成独立分支。锥虫TbSLP与CtSal共享YDC(F/Y)活性位点特征，其注释为"硫解酶样蛋白"可能错误，实际功能应为醛缩酶。

研究意义
该研究首次阐明C₅类固醇侧链醛缩酶的原子结构，揭示硫解酶折叠蛋白通过关键残基重塑实现催化功能分化的进化范式。发现DUF35结构域通过锌配位模式调控底物选择性，为理解蛋白结构-功能进化提供新案例。对TbSLP功能的重新界定将推动原生生物类固醇代谢研究，而CtSal的工程化改造有望应用于类固醇药物C₅/C₃侧链的精准修饰。论文发表于《Journal of Biological Chemistry》，为微生物转化合成高值类固醇化合物奠定了酶学基础。