基于SNP的双探针实时PCR技术：一步法快速鉴定环形泰勒虫及其布帕伐醌耐药株

针对布帕伐醌(Buparvaquone)耐药性威胁畜牧业生产的现状，研究人员开发了靶向细胞色素b(Cytb)基因的双探针TaqMan-MGB实时PCR技术。该研究首次鉴定出6个Cytb基因点突变，建立可同时检测环形泰勒虫(T. annulata)感染和耐药基因型(灵敏度达1×101 copies/μl)的一步法检测体系，在中国五省现场样本中检出21.7%感染率和4.3%耐药率，为热带泰勒虫病治疗和耐药监测提供高效工具。

　　

热带泰勒虫病是由蜱传原虫环形泰勒虫(Theileria annulata)引起的牛群重大疫病，每年威胁着亚欧非2.5亿头牲畜的健康。布帕伐醌(Buparvaquone)作为主要治疗药物，其耐药性问题日益严峻——中国新疆等地已出现治疗失败案例。耐药机制与细胞色素b(Cytb)基因突变密切相关，但传统Sanger测序检测耗时长，现有TaqMan方法又无法区分混合感染。这一诊断瓶颈严重制约着耐药株的早期发现和精准用药。

中国农业科学院兰州兽医研究所的研究团队在《Parasites》发表创新成果，开发出双探针特异性实时PCR技术。该研究通过分析实验室适应株(TaNM1敏感株/TaXJS耐药株)和现场分离株，锁定Cytb基因6个关键突变位点(包括新发现的753/843位点)，设计VIC/FAM双标记的TaqMan-MGB探针，建立可同步检测病原感染和耐药基因型的一步法体系。关键技术包括：1)基于中国五省531份牛血样建立地理分布图谱；2)优化探针浓度(150-200 nM)实现ACT/ACC基因型判别；3)构建标准质粒(T-XJS/T-NM1)验证方法灵敏度(10¹ copies/μl)和重复性(CV<1.93%)；4)二维散点图可视化实现无需后处理的快速判读。

【SNP检测】通过比对Ankara株(XM949625.1)参考序列，在Cytb基因鉴定出234/348/417/753/843/870六个突变位点，其中753(M→I)和843(L→F)为首次报道。

显示耐药株特有的ACC突变模式。

【方法建立】探针特异性验证显示：FAM信号仅出现在耐药株(T-XJS)，VIC信号仅见于敏感株(T-NM1)，而混合模板产生双重荧光。

标准曲线R²>0.999证实定量可靠性。

【现场应用】新疆样本中检出23例耐药株(占阳性样本20%)，全部携带ACC突变型，与测序结果100%吻合。

值得注意的是，这些耐药株集中出现在中国-中亚边境地区，提示跨国牲畜贸易可能是耐药基因传播的重要途径。

该研究实现了三大突破：1)将传统两步骤检测(病原鉴定+耐药分析)整合为单管反应，检测时间从48小时缩短至1小时；2)灵敏度较既往TaPIN1检测法提升27倍；3)首次揭示中国西北边境耐药株的跨境传播风险。所建立的技术平台为"一带一路"沿线国家的热带泰勒虫病联防联控提供了关键工具，其双探针设计策略也为其他原虫耐药性检测提供了范式参考。未来需扩大监测网络，重点关注中亚-中国边境地区的耐药株动态传播。