大肠杆菌β-内酰胺酶的协同耐药性差异研究：揭示交叉保护机制与持续胞外活性的关键作用

本研究针对β-内酰胺酶介导的协同耐药性机制展开深入探索，通过分析2637株大肠杆菌基因组数据并实验验证7种代表性β-内酰胺酶基因（blaampC、blaTEM-1等），发现质粒（尤其是接合型）是β-内酰胺酶基因的主要载体。研究证实所有测试酶类均具有协同耐药性但效率各异，其强度与β-内酰胺酶活性和最小抑菌浓度（MIC）呈正相关，且高胞外活性可产生环境耐药遗留效应。该成果发表于《Communications Biology》，为理解耐药基因传播机制和优化抗生素联合治疗方案提供了重要依据。

　　

抗生素耐药性已成为全球公共卫生的重大威胁，其中β-内酰胺类抗生素耐药尤为突出。β-内酰胺酶（β-lactamases）作为细菌抵抗这类抗生素的关键武器，不仅能保护产酶菌自身，还能通过"公共物品效应"救助邻近敏感菌，这种现象被称为协同抗生素耐药（cooperative antibiotic resistance）。然而，不同类别β-内酰胺酶的协同耐药效率差异及其决定因素尚不明确，这直接影响了联合用药策略的制定和耐药传播的防控。

针对这一科学问题，丹麦奥胡斯大学的研究团队在《Communications Biology》发表了一项开创性研究。通过对2637株大肠杆菌基因组进行生物信息学分析，结合7种代表性β-内酰胺酶（涵盖A、B、C、D四类）的实验验证，系统揭示了协同耐药性的分子机制和生态影响。

研究采用基因组挖掘、荧光标记流式细胞术、β-内酰胺酶活性检测和交叉保护实验等关键技术。从2637株临床分离大肠杆菌中提取β-内酰胺酶基因分布特征，构建染色体/质粒（接合型pKJK5及其非接合突变体pKJK5_NC）表达系统，通过sfGFP/mCherry荧光标记量化协同效应，并利用硝基头孢菌素（nitrocefin）水解实验测定胞内外酶活性。

β-内酰胺酶基因在大肠杆菌中广泛分布且主要位于接合型质粒
基因组分析显示96.7%的菌株携带β-内酰胺酶基因，其中50.3%属于C类（主要为染色体bla_ampC），38.3%为A类。值得注意的是，质粒（尤其是接合型）携带的β-内酰胺酶基因数量与质粒大小呈正相关（ρ=0.37），单个质粒最多可携带35个β-内酰胺酶基因，显著高于染色体的最大携带量（12个）。

七种β-内酰胺酶均表现协同耐药但效率各异
实验选取bla_ampC、bla_TEM-1、bla_CTX-M-15、bla_CMY-2、bla_NDM-5、bla_KPC-2和bla_OXA-181进行研究。所有酶类在青霉素（PEN）和头孢噻吩（CEF）压力下均能救助敏感菌，但效率差异显著：bla_OXA-181和bla_ampC救助率最高，而bla_CMY-2和bla_NDM-5最低。质粒表达系统的协同效应强于染色体定位（p_adj<0.05），且野生型启动子（P_WT）驱动的表达效率普遍高于合成启动子P_A1-O4/O3。

协同耐药促进bla基因接合转移
在抗生素压力下，接合型质粒的转移效率惊人——平均87.9%的被救助敏感菌转化为转接合体（transconjugants）。这表明协同耐药通过维持潜在受体菌的存活，极大扩展了耐药基因的水平传播机会。

胞外活性决定环境耐药遗留效应
虽然总β-内酰胺酶活性（ρ=0.923）与MIC（ρ=0.839）对协同耐药的预测性优于胞外活性（ρ=0.774），但后者对"耐药遗留效应"至关重要。将产bla_KPC-2菌的培养上清（含高胞外活性）加入敏感菌体系后，可使后者在亚胺培南（IMP）浓度超过MIC15倍的环境中存活，这种保护效应可持续至环境中的酶活性降解。

交叉保护挑战联合用药策略
研究发现产不同β-内酰胺酶菌株间存在交叉保护：bla_CTX-M-15（抗头孢噻肟）和bla_KPC-2（抗碳青霉烯类）的共培养菌群能在双抗生素（如IMP+CTX）组合下生长，而各自单培养时则被抑制。这种互作可能削弱β-内酰胺类与β-内酰胺酶抑制剂联用策略的疗效。

该研究首次系统比较了四类β-内酰胺酶的协同耐药特性，揭示质粒拷贝数、启动子强度和胞外活性是决定协同效率的关键因素。特别重要的是，研究发现高胞外活性的β-内酰胺酶可在环境中形成持久的耐药屏障，这为解释临床观察到的"抗生素治疗失败后环境持续选择耐药菌"现象提供了机制解释。此外，交叉保护现象的证实提示现行联合用药方案可能需要根据当地流行的β-内酰胺酶谱系进行优化。这些发现不仅深化了对细菌社会行为（social behavior）的理解，也为开发针对协同耐药的新型干预策略奠定了理论基础。