基于酶解-LC-MS/MS技术的过氧化物诱导Peroxiredoxin 2中Asp46差向异构化机制研究

本研究针对氧化应激中氨基酸立体构型变化的检测难题，通过建立"胰凝乳蛋白酶-氨肽酶M"两步酶解结合LC-MS/MS技术，首次揭示了过氧化物诱导Prx2活性位点Asp46发生L→D型差向异构化（AAE）的规律，并证实该修饰会降低Prx2与靶蛋白结合力，为氧化应激相关疾病标志物开发提供了新思路。

　　

在生命活动中，蛋白质的精确三维结构决定其生物学功能。然而鲜为人知的是，组成蛋白质的氨基酸会发生神秘的"镜像翻转"——即从天然L型转变为D型的差向异构化（Epimerization）。这种变化如同给蛋白质戴上"左手套"，虽然分子量不变，却可能彻底改变蛋白质的功能特性。其中天冬氨酸（Asp）因其特殊的化学结构，成为最易发生这种变化的氨基酸。更值得注意的是，活性氧（ROS）和过氧化物会显著加速这一过程，这可能是氧化应激导致蛋白质功能异常的新机制。

作为细胞内重要的抗氧化酶，过氧化物酶2（Peroxiredoxin 2, Prx2）在清除过氧化氢（H₂O₂）和维护氧化还原平衡中发挥关键作用。其活性位点中的Asp⁴⁶位于高度保守的YPLDF肽段，这个位点的构型变化可能直接影响酶活性。然而，传统质谱技术难以区分L/D型氨基酸，使得这一重要修饰长期被忽视。

为解决这一技术难题，江苏某高校的研究团队创新性地开发了"两步酶解-LC-MS/MS"分析方法，首次系统研究了叔丁基过氧化氢（TBHP）诱导的Prx2中Asp⁴⁶差向异构化（AAE）现象。相关成果发表在《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》上。

关键技术方法包括：1）建立胰凝乳蛋白酶与氨肽酶M（APM）的级联酶解体系，利用APM对D型氨基酸的特异性识别；2）开发能分离YPL_LDF/YPL_DDF异构体的LC-MS/MS方法；3）采用分子对接模拟D-Asp⁴⁶对Prx2蛋白互作的影响；4）分别处理分离的Prx2蛋白和完整红细胞（RBCs）样本，比较不同氧化条件下的AAE程度。

【Two-step enzymatic hydrolysis for the detection of peroxide-induced epimerization of Asp⁴⁶ residue in Prx2】
研究发现，TBHP处理会导致Prx2中Asp⁴⁶发生时间依赖性的L→D型转化。在分离Prx2蛋白模型中，随着反应时间延长，D-Asp⁴⁶含量显著增加。更令人惊讶的是，在完整红细胞中同样观察到这一现象——当红细胞暴露于TBHP后，其内源性Prx2也呈现类似的AAE动力学特征。

【Discussion】
分子对接分析揭示，Asp⁴⁶构型改变会削弱Prx2与靶蛋白的结合能力。这可能是由于D-Asp引入破坏了活性位点的精确空间排布。值得注意的是，Prx2在动脉粥样硬化、阿尔茨海默病等多种疾病中表达异常，而本研究首次将AAE修饰与Prx2功能失调联系起来，为理解这些疾病的分子机制提供了新视角。

【Conclusions】
该研究不仅建立了灵敏特异的AAE检测方法，更重要的是揭示了氧化应激通过诱导蛋白质构型变化影响功能的新机制。发现Prx2活性位点的D-Asp⁴⁶可作为氧化损伤的新型分子标志物，为相关疾病的早期诊断和靶向干预提供了潜在突破口。未来研究需进一步阐明AAE在活体中的生物学效应及其与疾病进展的关联。

（注：作者Limin Wang、Mohamed Abdulbagi、Bo Li等来自中国研究机构，论文受江苏省自然科学基金资助）