新型假单胞菌源甲硫氨酸γ-裂解酶的纯化表征及其靶向抗癌机制研究

本研究从本土假单胞菌(Pseudomonas mosselii)中成功纯化出高活性甲硫氨酸γ-裂解酶(MGL)，通过热处理、离子交换层析和凝胶过滤实现6.87倍纯化，酶活达61.16 U/mg。该酶在pH 6、30-37℃条件下展现最佳活性，能特异性诱导MCF-7、HepG-2等癌细胞凋亡，同时上调caspase-3、下调BCL-2基因表达。研究为开发靶向甲硫氨酸依赖型癌症的新型酶疗法提供了重要依据。

　　

在癌症治疗领域，肿瘤细胞对甲硫氨酸(Methionine)的特殊依赖性一直是个引人入胜的研究方向。与正常细胞不同，多种癌细胞无法通过转硫途径利用同型半胱氨酸(Homocysteine)，必须依赖外源甲硫氨酸维持增殖——这个独特的代谢弱点为靶向治疗提供了突破口。甲硫氨酸γ-裂解酶(Methionine gamma-lyase, MGL)正是利用这一特性，通过催化甲硫氨酸分解为α-酮丁酸和甲硫醇，切断癌细胞的"营养供应链"。然而现有MGL制剂存在纯化效率低、稳定性差等问题，亟需开发新型高效酶源。

来自伊朗伊斯法罕省的研究团队在《BMC Biotechnology》发表的研究，从本土分离的Pseudomonas mosselii菌株中成功获取高纯度MGL。研究人员采用三步纯化策略（热处理、CM Sephadex C-50离子交换、Sephadex G100凝胶过滤），结合HPLC和SDS-PAGE验证纯度，系统评估了酶的生化特性。通过MTT法检测四种癌细胞系的敏感性，并首次通过实时荧光定量PCR揭示了MGL调控凋亡基因的分子机制。

材料与方法
研究使用从伊斯法罕花园土壤分离的P. mosselii MN02菌株，经M9培养基发酵后，通过热处理（55-70℃梯度）、离子交换层析（pH 7.2磷酸钾缓冲液）和凝胶过滤纯化酶液。酶活性采用Nessler法测定氨释放量，蛋白浓度通过Bradford法检测。抗癌活性测试选用MCF-7、HepG-2等四种癌细胞系和正常黑色素细胞HFB4，通过MTT法计算IC₅₀。基因表达分析采用实时荧光定量PCR检测caspase-3和BCL-2 mRNA水平。

纯化与表征
纯化过程获得比活61.16 U/mg的MGL，回收率58.43%，SDS-PAGE显示单一48 kDa条带：

。HPLC验证纯度达99.62%：

。酶学特性显示最适pH为6，在30-37℃保持稳定，45℃处理2小时仍保留90%活性（图3a-d）。金属离子实验证实该酶无需辅因子，但Mg²⁺和Ba²⁺可抑制70%活性（表3）。

底物特异性与动力学
酶对L-甲硫氨酸具有高度特异性，对L-半胱氨酸和同型半胱氨酸的相对活性分别为88%和50%（图4）。Lineweaver-Burk分析显示K_m=8.458 mM，V_max=0.2702 U/mL/min（图5），反应15分钟达峰值活性（图6）。

抗癌活性
MTT实验显示MGL对U87MG胶质母细胞瘤细胞最敏感（IC₅₀=74 μg/mL），其次是MCF-7（123 μg/mL）和HepG-2（125 μg/mL），对正常细胞HFB4无毒性（图7e）。基因表达分析揭示MGL处理组caspase-3表达显著上调，BCL-2下调3-5倍（图8），其中U87MG细胞凋亡效应最显著。

讨论与结论
该研究首次系统报道了P. mosselii源MGL的纯化工艺与抗癌机制。相较于既往报道的微生物源MGL（如Aspergillus flavipes的47 kDa、Candida tropicalis的46 kDa），本研究获得的48 kDa酶具有更优的热稳定性（45℃稳定）和底物特异性。特别值得注意的是，该酶通过双重调控凋亡通路（激活caspase-3/抑制BCL-2）实现选择性抗癌，为克服传统化疗耐药提供了新思路。

研究意义在于：①建立高效低成本的三步纯化方案，较传统方法提高6倍纯度；②首次证实P. mosselii MGL对胶质母细胞瘤的显著抑制效果；③阐明酶处理诱导的基因表达变化模式，为联合用药提供分子标记。这些发现为开发基于甲硫氨酸饥饿策略的靶向抗癌疗法奠定了重要基础，未来可进一步探索该酶在心血管疾病（通过降解同型半胱氨酸）和抗感染领域的应用潜力。