工程化自切割融合系统生产嵌合蜘蛛丝蛋白的研究

本研究针对蜘蛛丝蛋白(Spidroin)大规模生产中的表达难题，开发了一种结合NusA融合标签与自切割内含肽(Mini-Intein ΔI-CM)的新型表达系统，成功实现了三种不同重复单元数的嵌合蜘蛛丝蛋白(NT2RepCT/NT4RepCT/NT6RepCT)的可溶性表达，最高产量达266 mg/L。通过CD和FTIR证实其二级结构从溶液态α-螺旋向干燥态β-片层转变，AFM显示NT4RepCT/NT6RepCT可自组装成类天然丝蛋白的纳米纤维网络。该成果为高性能人造蜘蛛丝材料制备及难表达蛋白生产提供了新策略。

　　

蜘蛛丝以其超越钢铁的强度成为材料科学界的"圣杯"，但蜘蛛的独居习性使大规模养殖不可行。传统基因工程方法面临GC含量高、质粒不稳定和蛋白错误折叠三重挑战，导致重组蜘蛛丝蛋白(Spidroin)产量低且多以包涵体形式存在。南京工业大学和安徽农业大学的科研团队在《BMC Biotechnology》发表研究，创新性地将NusA(核糖体结合蛋白)融合标签与自切割内含肽(Mini-Intein ΔI-CM)结合，构建了"一箭三雕"的表达系统：增强可溶性表达、实现无外源蛋白酶的自切割、简化下游纯化流程。

研究采用HindIII/XhoI双酶切构建pET43.1a(+)-NusA-intein-NTnRepCT载体，通过头尾策略增加重复单元。关键实验技术包括：①IPTG诱导条件优化（浓度0.3 mM，20℃诱导24小时）；②Ni²⁺-NTA亲和层析纯化；③圆二色谱(CD)分析溶液态二级结构；④原子力显微镜(AFM)观测纳米纤维自组装；⑤傅里叶变换红外光谱(FTIR)解析干燥态β-片层含量。

氨基酸序列分析与NusA-intein-NTnRepCT构建
从园蛛(Euprosthenops australis)中选取MaSp1基因序列，设计含2/4/6个重复单元(REP)的嵌合体。Kyte-Doolitle疏水性分析显示，随着REP单元增加，蛋白呈现周期性亲疏水变化（图1）。表达系统包含NusA、intein和6×His标签（图1c），对照组无标签时仅产生包涵体。

NTnRepCT蜘蛛丝蛋白的表达与纯化
SDS-PAGE显示NT6RepCT表观分子量(56 kDa)高于理论值(46 kDa)，可能因自聚集导致迁移异常（图2）。优化后三种蛋白可溶性表达量分别为266/135/125 mg/L，纯度>95%（图3）。Western blot验证目标蛋白表达（图S4）。

二级结构分析与自组装能力
CD谱图显示溶液态以α-螺旋为主（图4），干燥态FTIR显示β-片层含量随REP增加而升高（NT6RepCT达41.3%）（图6-7，表1）。AFM观察到NT4RepCT/NT6RepCT在60℃孵育48小时后形成直径约6 nm的纳米纤维网络（图5d,f），而NT2RepCT仅形成10-25 nm聚集体（图5b）。

该研究突破性地实现了高重复序列蜘蛛丝蛋白的可溶性表达，其自组装形成的β-片层纳米纤维网络与天然丝蛋白高度相似。相比传统方法，新系统省去了外源蛋白酶切割步骤，产量较文献报道提高2-6倍。不仅为军事、医疗用高性能人造蜘蛛丝生产奠定基础，更为胶原蛋白等复杂结构聚合物的制备提供了新思路。未来通过高密度发酵工艺优化，有望进一步突破产量瓶颈，推动生物材料领域的革新。