模糊测序技术：突破DNA片段计数与基因分型的信息效率瓶颈

本研究针对当前高通量测序技术信息效率低下的核心问题，开发了基于双核苷酸添加流式（BitSeq）和超比特测序（SuperBitSeq）的模糊测序策略。通过创新的氟原性测序化学和微流控芯片技术，实现了>2 bits/cycle的信息效率，在CNV检测、NIPT、RNA-seq等应用中展现出比传统CRT测序更快的周转速度和更高准确性，为基因组学研究提供了新型工具。

　　

基因组测序技术近年来虽取得长足进步，但传统循环可逆终止（CRT）测序方法的信息效率始终局限在2 bits/cycle。这种效率瓶颈导致测序周期长、成本高，特别是在需要精确DNA片段计数的应用中，如拷贝数变异（CNV）检测、无创产前检测（NIPT）和转录组分析（RNA-seq）等。更关键的是，现有技术难以兼顾单碱基分辨率和高效信息编码，这成为制约临床诊断和基础研究的重要技术壁垒。

针对这一挑战，清华大学的研究团队在《Nature Biomedical Engineering》发表了一项突破性研究。他们创新性地提出"模糊测序"概念，通过重新设计测序信息编码方式，开发出信息效率超过传统方法两倍的新型测序技术。该研究不仅构建了功能完备的高通量模糊测序仪原型机，更在多种应用场景中验证了其优越性能，为基因组学研究提供了全新的技术路径。

研究团队主要采用了三项核心技术：1）基于末端磷酸标记氟原性核苷酸（TPLFN）的测序化学，实现核苷酸延伸数与荧光信号的线性对应；2）双核苷酸添加流式（BitSeq）和超比特测序（SuperBitSeq）策略，通过交替添加混合核苷酸提高信息密度；3）30飞升微流控芯片阵列，采用可逆油封技术防止荧光信号交叉干扰。临床样本包括先天性心脏病患者外周血DNA、孕妇游离DNA（ccfDNA）以及社区获得性肺炎患者的支气管肺泡灌洗液等。

【结果】

模糊测序策略设计

研究团队开发的模糊测序策略突破了传统四碱基编码限制，通过交替添加混合核苷酸（如K=G/T，M=A/C）实现信息压缩。BitSeq采用双色荧光系统，信息效率达2.32 bits/cycle；而SuperBitSeq使用东京绿（TG）和北京橙（PO）双荧光标记，效率进一步提升至3.32 bits/cycle。这种设计使相同循环数下可获得更长读长，如61循环平均读长达112.2 bp。

测序仪实现与性能验证

构建的实验室原型测序仪包含2800万个30飞升微反应室，采用温度触发（4-65°C）的氟原性SBS化学。在λ噬菌体基因组测试中，6,578,364条reads的比对率达99.11%，错误率首10 bp仅0.39%。微流控芯片的油封技术使信号串扰低于1%，解决了扩散导致的信号混合问题。

CNV检测应用

在唐氏综合征（21三体）和DiGeorge综合征（22q11.2缺失）检测中，BitSeq表现出比Ion Torrent更低的绝对配对差异中位数（MAPD）。对2.9 Mb的22q11.2缺失检测，BitSeq与常规方法一致性达100%，且所需测序循环数减少30%。

NIPT性能评估

在12例模拟三体样本（21/18/13三体）和28例真实临床样本中，BitSeq在胎儿DNA占比≥3.5%时能准确识别三体（Z>3）。对10例单盲样本检测结果与临床诊断完全一致，证实其临床适用性。

微生物组与RNA-seq分析

在儿科多器官脓肿患者的咽拭子样本中，BitSeq与Illumina检测的病原体种类和丰度高度一致（R²>0.95）。小鼠胚胎干细胞（mES）和成纤维细胞（mEF）的RNA-seq数据显示，BitSeq与常规测序的基因表达相关性达0.98，检测基因数差异<5%。

SuperBitSeq的SNV检测能力

通过EGFR基因G719S/T790M突变检测实验，SuperBitSeq成功区分单碱基差异的DNA模板。在SARS-CoV-2样本测序中，42.6分钟内获得20万条reads，SNV检出率比BitSeq提高83%，错误率<1%。

【结论与讨论】
这项研究从根本上改变了DNA测序的信息编码范式，通过模糊测序策略实现了信息效率的突破。其核心价值体现在三个方面：首先，双核苷酸流式设计使单位循环信息量提升116%，大幅缩短了CNV、NIPT等依赖片段计数应用的检测时间；其次，创新的氟原性化学结合微流控密封技术，解决了高通量下的信号保真问题；最重要的是，SuperBitSeq通过双色荧光系统实现了单碱基变异检测，填补了模糊测序在精准医学中的应用空白。

研究还揭示了模糊编码的数学特性——SuperBitSeq信号在[0,1)×[0,1)空间形成豪斯多夫维数≈1.7716的分形结构，这为开发新型序列比对算法提供了理论基础。尽管当前技术仍需优化操作流程和降低成本，但其在表观遗传学（如甲基化测序）和三维基因组（如Hi-C）等领域的应用前景已清晰显现。这项技术突破不仅为基因组学研究提供了新工具，更重新定义了测序信息效率的理论上限。