离子液体修饰反相高效液相色谱法测定果汁中抗坏血酸的新方法及其保留机制研究

推荐：本研究针对果汁中抗坏血酸（AA）定量分析的选择性不足问题，首次将离子液体（ILs）四丁基甲烷磺酸盐（TBA-MSA）作为反相高效液相色谱（RP-HPLC）流动相修饰剂，开发了一种高精度方法。研究发现TBA浓度升高意外降低AA保留时间，揭示了其通过离子交换机制稳定AA的特性。该方法线性范围1.56–100 mg·L?1，平均准确度100%，为深色果汁维生素C分析提供了新策略。

　　

抗坏血酸（Ascorbic Acid, AA）作为食品中重要的抗氧化剂和人体必需维生素，其精准定量一直是分析化学的挑战。尽管高效液相色谱（HPLC）是目前最可靠的方法，但传统流动相添加剂如三氟乙酸（TFA）存在环境风险，磷酸盐缓冲液易沉淀，而硫酸具有腐蚀性。更棘手的是，果汁中高浓度的柠檬酸等有机酸会干扰AA检测，且AA极性强，在反相色谱中保留困难。针对这些问题，格但斯克大学的研究团队在《Microchemical Journal》发表论文，首次将离子液体（Ionic Liquids, ILs）四丁基甲烷磺酸盐（TBA-MSA）作为RP-HPLC流动相修饰剂，开发了一种高效、环保的AA定量方法，并揭示了TBA阳离子与AA阴离子的独特相互作用机制。

研究采用HPLC-DAD（二极管阵列检测器）系统，以C18色谱柱为核心，对比了铵盐缓冲液与不同浓度TBA-MSA/TBA-Cl的分离效果。通过梯度洗脱（5–50%乙腈）优化分离条件，结合标准添加法和Tillman滴定法验证准确性。样本队列包括9种新鲜/巴氏杀菌果汁（如橙汁、蓝莓汁），通过pH调节、DTT（二硫苏糖醇）还原和离心预处理消除基质干扰。

3.1 标准流动相中AA保留行为
研究发现，传统铵盐缓冲液（pH 6）中AA无保留，酸化至pH 3仅延长保留0.2分钟。橙汁分析时，AA峰与基质成分共洗脱，导致定量偏差（图1），凸显传统方法的局限性。

3.2 离子液体流动相的保留机制
突破性发现是：TBA浓度增加反而降低AA保留时间（图2），与常规离子对试剂规律相反。通过对比TBA-Cl和TBA-MSA，证实TBA阳离子通过形成动态电荷复合物（图3）主导保留：低浓度时AA-TBA吸附于固定相，高浓度时复合物因静电排斥转入流动相。MSA阴离子则通过竞争吸附提升峰形，使理论塔板数翻倍。

3.3 果汁预处理优化
果汁pH需调至6.5（匹配流动相），并预混10 mM TBA-MSA以抵消柠檬酸等阴离子的竞争。最终方法仅需10分钟预处理，AA回收率达107%（表1），且TBA意外表现出稳定AA的作用——24小时内水溶液中AA降解40%，而TBA-MSA中保持95%以上稳定性。

3.5 实际样品分析
HPLC与Tillman法结果总体一致（表2），但柑橘类果汁差异显著（如柠檬汁：HPLC 38.7 vs 滴定46.8 mg/100 mL）。巴氏杀菌果汁的AA含量普遍高于标签值（如黑加仑果蜜实测9–16 vs 标称6 mg/100 mL），提示厂商标注可能存在批次偏差。

该研究不仅首次将ILs应用于AA定量，更颠覆了人们对四烷基铵离子在RP-HPLC中行为的认知。1 mM TBA-MSA即可实现优异分离，成本仅0.12欧元/次，且避免氟化物污染。尽管无法区分L/DHAA异构体，但其在深色果汁中的抗基质干扰能力（图5）和AA稳定特性，使其成为替代滴定法和传统HPLC的理想选择。未来可进一步探索TBA对其他极性化合物的普适性机制，为食品和药物分析开辟新路径。