基于链霉亲和素平台固定化适配体的ELISA系统检测人D-二聚体蛋白的性能优化研究

本研究针对传统抗体ELISA成本高、生产周期长的问题，开发了基于链霉亲和素(streptavidin)固定化适配体(aptamer)的ELISA检测系统。通过优化温度(37°C)、缓冲液(Tris-HCl pH 7.5)、孵育时间(1.5 h)和适配体浓度(50 μg/mL)等参数，实现了对血栓标志物D-二聚体的高灵敏度检测，其性能与抗体ELISA相当，同时显著降低时间和经济成本，为临床血栓性疾病诊断提供了新选择。

　　

在临床诊断领域，D-二聚体作为纤维蛋白降解产物，是血栓性疾病如深静脉血栓(DVT)、肺栓塞(PE)的重要标志物。目前主流的检测方法——酶联免疫吸附试验(ELISA)虽灵敏度高，但依赖抗体识别，存在生产成本高、周期长等瓶颈。而人工合成的适配体(aptamer)因其高亲和力、稳定性及可化学修饰等优势，成为替代抗体的理想选择。

为突破这一技术壁垒，沙希德·萨杜吉医科大学的研究团队创新性地将生物素化(biotinylated)适配体固定于链霉亲和素(streptavidin)包被平台，构建了新型ELISA系统。研究通过系统优化温度、缓冲液pH值、孵育时间等关键参数，发现37°C、Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)、1.5小时孵育及50 μg/mL适配体浓度条件下，系统性能达到最优。实验证实该体系不仅保持了与传统抗体ELISA相当的灵敏度，还实现了标准曲线的线性响应，同时对血浆干扰蛋白(如白蛋白、纤维蛋白原)表现出优异特异性。

关键技术包括：1) 基于专利(PCT/US2018/059149)筛选K_d值为2.5 nM的高亲和力适配体；2) 通过260 nm/280 nm吸光度验证适配体-靶标结合；3) 使用HRP-链霉亲和素(HRP-streptavidin)和TMB显色系统进行信号检测；4) 以VIDAS? D-Dimer Exclusion? II作为参比方法验证性能。

【结果】

1. 材料优化：确定Pierce?链霉亲和素包被板与50 μg/mL生物素化适配体的最佳组合；
2. 条件优化：37°C和中性pH环境显著提升适配体结合效率；
3. 性能验证：系统对D-二聚体的检测限达纳摩尔级，且与临床自动化检测结果高度一致；
4. 经济性评估：较抗体生产节省约60%时间和80%成本。

【结论与意义】
该研究首次证实适配体ELISA在D-二聚体检测中可完全替代传统抗体方法。其创新性体现在：1) 通过生物素-链霉亲和素系统实现适配体高效定向固定；2) 参数优化使检测灵敏度达临床要求；3) 为开发电化学生物传感器奠定基础。团队建议未来研究可探索修饰型适配体在多重标志物检测中的应用，这将推动低成本、高通量血栓诊断技术的发展。作者Elham Owlia等强调，该方法尤其适合资源有限地区的血栓筛查，具有重要公共卫生价值。