CRISPR驱动的环境铜绿假单胞菌株强化烃类乳化：基因编辑助力生物表面活性剂生产新突破

本研究针对石油污染治理难题，创新性地利用CRISPR/Cas9-APOBEC1-UGI系统对墨西哥湾石油污染区分离的铜绿假单胞菌IGLPR01进行rpoS基因编辑，成功构建了高产吡咯喹啉醌(PYO)和鼠李糖脂(RMLs)的工程菌株。该突变株的细胞游离上清对汽油乳化指数提升30.6%，为环境菌株的基因编辑和生物修复应用提供了方法论框架。

　　

石油泄漏造成的生态灾难一直是全球性难题。传统物理化学处理方法效率低下，而微生物修复技术因其环境友好特性备受关注。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)作为常见的环境微生物，能产生吡咯喹啉醌(PYO)和鼠李糖脂(RMLs)等天然乳化剂，但其野生菌株产量有限且存在潜在生物安全风险。如何通过基因编辑提升环境菌株性能，同时评估其应用潜力，成为当前研究的关键突破口。

蒙特雷理工学院等机构的研究团队从墨西哥湾石油污染区分离获得一株环境铜绿假单胞菌IGLPR01，通过全基因组测序和代谢通路分析，确认其携带完整的PYO和RMLs生物合成基因簇。研究创新性地采用CRISPR/Cas9-APOBEC1-UGI碱基编辑系统靶向修饰rpoS基因，成功获得高产突变株，相关成果发表于《Microbial Cell Factories》。

研究主要采用三种关键技术：1）基于Illumina和Nanopore平台的混合基因组组装技术解析环境菌株基因组特征；2）CRISPR/Cas9-APOBEC1-UGI碱基编辑系统实现非模式菌株精准基因修饰；3）LC-MS/MS代谢组学分析结合分子网络技术（GNPS）鉴定PYO和RMLs等代谢物。

P. aeruginosa IGLPR01测序与基因组分析
通过MaSuRCA混合组装获得6.68 Mb单环状基因组（GC含量66.19%），注释显示其编码13%多于临床菌株PAO1的蛋白质。TYGS全基因组分类确认其属于铜绿假单胞菌第2组，与致病菌PA14亲缘最近。

基因组功能注释
antiSMASH分析发现两个吩嗪合成基因簇（phzA1-G1和phzA2-G2）及完整的RMLs合成操纵子（rhlAB）。CARD数据库检测到15个完美匹配的抗生素抗性基因（如MexI外排泵），基因组岛预测揭示多个毒力相关基因（如T3SS分泌系统组件）。

CRISPR/Cas基因编辑
针对传统同源重组效率低的问题，选用含UGI蛋白的pMBEC6载体系统，将编辑窗口扩展至sgRNA间隔区3-8位。测序证实31.5%转化子成功引入Q157*无义突变（CAG→TAG），编辑效率呈现位置依赖性（3-5位100%，8位62.5%）。

代谢表型分析
rpoS-STOP突变株表现出：1）生长抑制（OD₆₀₀降低33%）；2）PYO产量提升3.7倍（2780.24 vs 1028.66 μg/gCDW）；3）RMLs增加2.1倍（通过C₁₀-C₁₀、Rha-C₁₀-C₁₀等分子鉴定）；4）汽油乳化指数提高至30.6%（p<0.01）。代谢调控机制分析表明，rpoS缺失可能通过解除对rhlI的抑制，激活RhlR-rhlAB调控级联。

该研究首次在环境铜绿假单胞菌中建立CRISPR碱基编辑平台，证实rpoS作为全局调控因子可同时提升PYO和RMLs产量。虽然菌株携带毒力基因，但通过编辑策略证明环境分离株可作为生物表面活性剂生产的候选底盘。研究为非模式菌株的基因改造提供了可推广的方法论，强调未来需结合毒力基因敲除（如T3SS组分）等安全策略。从应用角度看，PYO与RMLs的协同乳化效应（文献支持其可使石油回收率从65%提升至80%）为微生物强化采油(MEOR)技术开发提供了新思路。