毕赤酵母分泌表达固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶：工业级稀有糖生产新策略

本研究针对D-阿洛酮糖(D-psicose)工业化生产瓶颈，开发了基于毕赤酵母(Pichia pastoris)的分泌表达系统。研究人员通过密码子优化和α-因子信号肽融合策略，实现DPEase的高效分泌表达，并建立一步纯化固定化技术。该酶在pH 5.0-11.0和35-70°C保持80%以上活性，固定化后可重复使用5次（保留83.38%活性），为低热量甜味剂生产提供经济高效的解决方案。

　　

在追求健康饮食的浪潮中，低热量甜味剂D-阿洛酮糖(D-psicose)因其仅含0.4 kcal/g的热量和抗糖尿病等生理功能备受关注。这种稀有糖在自然界含量极低，传统化学合成法存在副产物多、纯化复杂等缺陷。虽然D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPEase)能催化D-果糖转化，但现有生产系统面临表达量低、纯化成本高、酶稳定性差等挑战。特别是大肠杆菌表达系统易形成包涵体，而农杆菌来源的DPEase存在生物安全风险。

泰国农业大学的研究团队在《Microbial Cell Factories》发表的研究中，创新性地选用毕赤酵母KM71作为宿主，通过密码子优化将Bacillus sp. KCTC 13219的DPEase基因与α-因子信号肽融合，构建分泌表达系统。利用C端6×His标签实现了一步纯化与固定化，建立了高效、低成本的D-阿洛酮糖生产平台。关键技术包括：毕赤酵母分泌表达系统构建、His标签亲和层析纯化、酶学性质表征（pH/温度稳定性、动力学参数测定）、以及70%(w/v)高浓度底物下的固定化酶柱连续转化实验。

DPEase表达盒设计与表达菌株构建
研究团队设计含AOX1启动子的4,414 bp重组质粒pPICZ(α)A+DPEase，通过电转化整合至毕赤酵母基因组。克隆1展现最高酶活（1.332 Unit/mL），SDS-PAGE显示34 kDa目标条带，证实分泌表达成功。

DPEase纯化
HisPrep FF 16/10柱纯化使比活提升至3.65 Unit/mg（纯化倍数12.54），电泳显示高纯度条带，流穿液无目标蛋白残留，证明固定化树脂高效捕获。

DPEase生化特性
该酶在pH 6.0（醋酸钠缓冲液）和60°C时活性最高，在pH 5.0-11.0和35-70°C保持80%以上相对活性。热稳定性实验显示55°C孵育1小时后保留90%活性，70°C时降至45.86%。动力学分析显示K_m=71.41 mg/mL，K_cat=99.17 s^-1，催化效率为1.39 mL·s^-1·mg^-1。

底物浓度与反应时间对转化的影响
10%(w/v)D-果糖在60分钟时转化率达16.89%，而70%(w/v)高浓度下因底物抑制仅达8.06%，揭示工业化需优化底物负载。

固定化DPEase验证
固定化酶柱在70%底物浓度下实现3.43%转化率，5次循环后活性保持83.38%，展示优异操作稳定性。

这项研究开创性地将毕赤酵母分泌表达与即时固定化技术结合，解决了DPEase生产中的成本与稳定性难题。酶在极端pH/温度下的卓越稳定性显著降低工业能耗，而一步纯化固定化策略简化了下游工艺。特别值得注意的是，该生产系统采用GRAS认证宿主，避免了细菌内毒素风险，为食品医药应用提供安全保障。研究团队提出的高底物浓度连续转化方案，为未来规模化生产提供了直接参考，有望推动D-阿洛酮糖在功能性食品和糖尿病辅助治疗领域的广泛应用。