Sec18/NSF通过侧向加载机制解离SNARE复合体的结构机制解析

本研究揭示了AAA+蛋白Sec18/NSF（N-ethylmaleimide-sensitive factor）通过独特的侧向加载机制解离SNARE复合体的分子机制。通过冷冻电镜（cryo-EM）和体内交联质谱（XL-MS）技术，研究人员发现Sec18/NSF在不展开SNARE蛋白N端结构域（如Habc结构域）的情况下，通过D1和D2环的协同开口实现底物的侧向加载和释放，解决了膜锚定SNARE蛋白的拓扑学难题。该发现为理解真核细胞膜融合过程中SNARE循环利用的分子机制提供了重要见解，发表在《Nature Structural & Molecular Biology》。

　　

在真核细胞中，膜融合是细胞区室化、神经递质释放等生命过程的核心环节，这一过程由SNARE（可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体）蛋白介导。SNARE蛋白通过其核心结构域形成平行的四螺旋束（four-helix bundle）驱动膜融合，而融合后形成的稳定cis-SNARE复合体需要被AAA+（多种细胞活动相关的ATP酶）蛋白Sec18/NSF及其适配体Sec17/α-SNAP解离，以供后续融合循环使用。然而，SNARE蛋白通常具有C端跨膜结构域或N端折叠结构域（如Sso1的Habc结构域），这些拓扑学约束使得传统认为的"完全穿线"解离机制难以实现。这一矛盾引发了科学界对Sec18/NSF如何解离各种SNARE复合体的长期疑问。

为解答这一难题，斯坦福大学医学院的Yousuf A. Khan、K. Ian White等研究人员开展了一项综合性研究。通过结合体内交联质谱（XL-MS）、单分子荧光共振能量转移（smFRET）和冷冻电镜（cryo-EM）等技术，系统研究了酵母Sec18-Sec17-SNARE复合体（y20S）的结构与功能。研究发现发表在《Nature Structural & Molecular Biology》上，揭示了Sec18/NSF通过创新的"侧向加载和释放"机制克服SNARE蛋白的拓扑学约束。

研究主要采用了四种关键技术方法：（1）体内交联质谱（XL-MS）分析酵母细胞中Sec18与SNARE蛋白的相互作用网络；（2）冷冻电镜解析非水解条件和水解条件下y20S复合体的高分辨率结构；（3）单分子FRET技术监测SNARE解离过程中Habc结构域的构象变化；（4）体外解离实验验证Sec18/NSF的功能活性。研究使用了酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为模型系统，并比较了酵母Sec18与哺乳动物NSF的功能保守性。

研究结果部分包含多个重要发现：

"SNARE disassembly requires Sec18/NSF side loading"部分通过体内XL-MS分析发现，Sec18的D2结构域与多个SNARE蛋白的N端区域存在高可信度交联，这一意外发现暗示了D2结构域在SNARE回收中的新作用。

"In vivo crosslinking mass spectrometry(XL-MS)with Sec18"详细展示了交联实验结果，发现七个高可信度D2交联中有五个连接至SNARE结构域N端区域，如Sso1的Habc结构域与Sec18 D2结构域的相互作用。

"The Sec18-Sec17-Sso1-Snc1-Sec9(y20S)complex"部分通过冷冻电镜解析了非水解条件下y20S复合体的八种结构类别，发现Sso1同时穿过了D1和D2孔，而其Habc结构域与D2环外侧相互作用，形成电荷互补的界面。

"Sec18 does not unfold the Sso1/syntaxin Habc domain"通过smFRET和化学交联实验证明，Sec18/NSF活性过程中Habc结构域保持折叠状态，不支持完全穿线模型。

"Substrate-released Sec18 reveals coordinated ring opening"和"Substrate-free Sec18 reveals coordinated ring opening"展示了水解条件下Sec18的D1和D2环协同开口的构象变化，为侧向释放机制提供了结构基础。

研究结论部分提出了一个四阶段的SNARE循环模型：（1）静息状态下Sec18/NSF形成开口构象；（2）Sec17/α-SNAP包被的cis-SNARE复合体被识别；（3）ATP水解驱动部分穿线解离；（4）底物通过D1-D2环侧向开口释放。这一机制解释了Sec18/NSF如何在不展开N端结构域的情况下处理各种拓扑学约束的SNARE蛋白。

该研究的科学意义在于：（1）首次揭示了AAA+蛋白通过侧向加载处理拓扑学约束底物的新机制；（2）阐明了Sec18 D2结构域在SNARE解离中的新功能；（3）为理解多种细胞过程中SNARE循环的分子基础提供了框架；（4）提出的机制可能也适用于其他AAA+蛋白如p97/cdc48。这些发现对深入理解膜 trafficking、神经递质释放等生理过程及相关疾病机制具有重要价值。