长读长测序技术在杜氏/贝氏肌营养不良症诊断中的应用：揭示复杂结构变异与深内含子突变

为解决传统基因检测方法（MLPA和NGS）在杜氏/贝氏肌营养不良症（DMD/BMD）复杂变异检测中的局限性，中南大学湘雅医院团队通过长读长测序（LRS）技术，成功在5例疑似患者中鉴定出深内含子突变、染色体易位和倒位等传统方法难以捕捉的变异，并结合肌肉活检和RNA测序验证。该研究为DMD/BMD的精准诊断提供了新策略，凸显了LRS在复杂遗传病诊断中的互补价值。

　　

研究背景与意义
杜氏肌营养不良症（Duchenne Muscular Dystrophy, DMD）和贝氏肌营养不良症（Becker Muscular Dystrophy, BMD）是由DMD基因突变导致的致死性遗传病，临床表现为进行性肌肉萎缩。尽管多重连接依赖性探针扩增（MLPA）和二代测序（NGS）已成为主流诊断手段，但约25-30%的患者因复杂结构变异（如易位、倒位）或深内含子突变无法确诊。传统技术的短读长特性限制了其对基因组复杂区域的解析能力，而长读长测序（Long-Read Sequencing, LRS）凭借数千至数万碱基的读长优势，为破解这一难题提供了新可能。

研究方法
中南大学湘雅医院团队对5例疑似DMD/BMD患者（4男1女）开展LRS检测，其中4例既往MLPA和NGS结果为阴性。技术流程包括：PacBio Sequel II/IIe平台的全基因组LRS、染色体G显带核型分析（针对女性患者）、X染色体失活（XCI）分析（通过HUMARA甲基化检测），并对未确诊者补充肌肉活检及RNA测序。

研究结果

1. 复杂结构变异的揭示

   • 患者2（女性）通过LRS发现X染色体与3号染色体平衡易位（t(X;3)(p21.1;p12.2)），核型分析确认断裂点为chrX:31,800,627-chr3:82,376,521。XCI分析显示极端偏斜失活（98:2），导致其携带的DMD基因突变显性表达，解释了女性罕见发病机制。
     
     
   • 患者3发现DMD基因外显子56区域倒位（chrX:g.31522381_31522386inv），传统MLPA未能识别。

2. 深内含子突变的发现
   患者4和5分别检出深内含子突变c.5325+1759G>C和c.1812+601A>G，这些变异可能通过影响剪接导致外显子跳跃。

3. RNA测序的互补价值
   患者1的LRS初筛阴性，但肌肉活检显示肌营养不良蛋白（dystrophin）表达缺失，RNA测序发现外显子19部分缺失，最终通过数据重分析锁定内含子18的delins突变（chrX:g.32519799_32519868delins32520928-32520965）。
   

   

结论与讨论
该研究证实LRS可突破传统技术的三大局限：

1. 减少侵入性操作：LRS直接识别复杂变异，降低肌肉活检依赖；
2. 纠正误诊：文献报道的“假性外显子重复”经LRS实为基因间插入，凸显其定位精准性；
3. 支持家系筛查：明确变异位点后，可指导女性携带者检测和产前诊断。

未来需优化LRS分析流程（如引入泛基因组参考），并扩大队列验证其作为一线诊断工具的潜力。该成果发表于《Italian Journal of Pediatrics》，为DMD/BMD的精准诊疗提供了新范式。