整合剪接分析工具优化NGS流程提升遗传性视网膜病变诊断率

为解决遗传性视网膜病变(IRD)中剪接变异体识别和解读的挑战，西班牙研究团队开发了一种整合13种剪接预测工具的NGS分析流程。通过训练集优化工具组合与阈值（SpliceAI+MaxEnt为主，BP Alamut用于分支点变异），在211例未确诊家系中新增6.2%诊断率，发现17个潜在致病性剪接变异。该研究发表于《npj Genomic Medicine》，为罕见病精准诊断提供了可推广的剪接变异分析框架。

　　

遗传性视网膜病变(IRD)是一组由290多个基因突变导致的视觉损伤性疾病，尽管二代测序(NGS)技术已广泛应用于临床诊断，仍有26-48%的病例无法明确病因。其中，影响前体mRNA剪接的变异体因组织特异性表达、非经典位点突变预测困难等问题，成为诊断瓶颈。西班牙塞维利亚大学医院团队在《npj Genomic Medicine》发表的研究，通过系统性整合剪接预测工具，显著提升了IRD的分子诊断效率。

研究团队首先构建包含1535个致病和2102个良性变异体的训练集，按变异类型分为经典剪接位点(CSS)、非经典剪接位点(NCSS)、深内含子(DI)、外显子同义(ES)和分支点(BP)五类。通过ROC曲线评估13种工具性能，发现SpliceAI与MaxEnt组合在多数变异类型中表现最优(AUC>0.8)，而BP Alamut专门适用于分支点变异。优化后的"SpliceAI+MaxEnt"模型使假阳性率降低50%，马修斯相关系数(MCC)提升至0.55。

关键技术包括：1)基于116例确诊患者的118个剪接变异验证流程；2)对211个未确诊IRD家系进行靶向测序(146基因)或全基因组测序(WGS)；3)使用冷冻外周血RNA进行CDH23基因剪接验证；4)通过PyMOL对BBS1蛋白异构体进行三维建模。

主要结果如下：
Benchmarking study and definition of optimal thresholds
通过训练集分析确立工具特异性阈值：CSS变异推荐CADD≥30.5，NCSS用SPiCE≥0.807，DI依赖SpliceAI≥0.105，BP需BP Alamut≤-17.072。

Combinatorial analysis
"SpliceAI+MaxEnt"组合较单一工具显著提升性能(p<3.357×10^-14)，在验证队列中成功检出88.98%已知致病剪接变异。

Application of the splicing pipeline
在211个家系中发现30个潜在致病变异(17个影响剪接)，包括：

• CDH23深内含子变异c.6713-1062G>A引发70bp伪外显子插入(突变转录本占比26.7%)
• CDH23分支点变异c.5924-21A>C导致205bp内含子滞留(突变占比50.4%)
• BBS1同义变异c.339T>C在非经典异构体(ENST00000537537.1)中产生错义突变p.Met17Thr

Genotype-phenotype correlations
6个非综合征型IRD家系携带BBS1、CHD7等"综合征基因"变异，提示剪接变异可能导致非典型表型。

该研究首次系统评估了剪接工具在临床诊断中的组合应用价值，6.2%的诊断率提升证实剪接变异是IRD的重要致病机制。发现的两个CDH23变异呈现不同外显率(26.7% vs 50.4%)，为表型异质性提供分子解释。研究还揭示非经典转录本(如BBS1的ENST00000537537.1)在视网膜中的表达可能改变变异致病性评估。建立的流程可推广至其他罕见病诊断，而鉴定的高频剪接变异(如CNGB3 c.1663-1205G>A)为反义寡核苷酸(AON)治疗提供靶点。这项工作标志着剪接变异分析从科研向临床转化的重要突破。