血液转录组测序在儿科基因组测序阴性队列中的诊断价值评估：揭示RNA-seq对遗传病诊断的强化与修正作用

本研究针对基因组测序(GS)阴性患儿开展血液转录组(RNA-seq)分析，通过半自动化临床级流程检测134例患儿样本，发现RNA-seq能为33%已确诊病例提供功能学证据，修正2例误诊(如将Noonan样综合征病例从EPG5修正为LZTR1)，并在7%未确诊病例中发现CEP120等新候选基因。该研究发表于《npj Genomic Medicine》，证实血液RNA-seq可作为GS的重要补充，为罕见病诊断提供转录组层面的功能证据。

　　

在罕见遗传病诊断领域，基因组测序(GS)虽已带来革命性进展，但仍有超过半数患者无法获得明确诊断。这种"诊断鸿沟"部分源于现有技术难以评估DNA变异的功能影响——比如一个错义突变是否会导致mRNA降解？内含子变异如何干扰剪接过程？这些关键问题正是多伦多病童医院(Hospital for Sick Children)基因组医学中心团队试图破解的科学难题。

研究人员选择了一个独特的队列：134名经过全面GS分析仍未能确诊的儿科患者，这些患儿临床表现涵盖癫痫、全面发育迟缓等复杂症状。通过建立标准化血液RNA-seq流程，团队系统评估了转录组数据在两种场景下的价值：一是为GS已发现的变异提供功能佐证，二是在未确诊病例中挖掘新的候选基因。这项开创性工作发表于《npj Genomic Medicine》，揭示了RNA层面分析如何补全基因组诊断的拼图。

关键技术方法包括：采用PAXGene管保存血样，结合SIRV/ERCC spike-in对照建立自动化RNA-seq文库制备流程；使用OUTRIDER算法检测基因表达异常，通过FRASER分析剪接变异，整合GTEx数据库评估等位基因特异性表达(ASE)；对拷贝数变异(CNV)区域基因进行表达定量，并与临床表型(HPO术语)关联分析。

RNA表达变化验证已知致病基因
在61例GS确诊病例中，39例目标基因可在血液中检测到。RNA-seq显示20例存在显著转录异常：9例呈现基因表达下调（如PPP3CA无义变异导致表达量降低3.95个z值），5例出现异常剪接（如DNAJC19纯合剪接位点缺失引发外显子4/5跳跃）。值得注意的是，两个错义变异病例(SLC25A19和BBS1)意外出现表达下调，后续分析发现分别伴有杂合缺失和转座子插入，凸显RNA-seq揭示复合变异的优势。

CNV区域的转录组剂量效应
9例携带致病CNV的病例中，6例缺失区域基因呈现剂量敏感性表达。典型如22q11.2缺失综合征患者，24个基因表达显著下调(z<-3)，但下调幅度各异（FC 0.37-0.69），提示不同基因对剂量变化的敏感度差异。X染色体复杂重排病例则显示剂量补偿现象：重复区基因表达上调而缺失区保持稳定，可能与X染色体失活偏移有关。

RNA-first策略发现新诊断线索
在73例未确诊病例中，RNA-centric分析发现7例(9.6%)具有临床相关异常：5例检出UGDH等表达异常基因，2例发现NFIX异常剪接。最具突破性的是Case 87——临床拟诊Noonan综合征但GS仅检出EPG5变异，RNA-seq发现LZTR1基因内含子区新型外显子激活，后经DNA重分析证实存在深在内含子变异c.1943-351G>C，最终修正诊断。另一ZTTK综合征患儿(SON突变)同时检出CEP120异常剪接，揭示可能的表型修饰机制。

这项研究确立了血液RNA-seq在临床基因组学中的三重价值：功能验证器、诊断修正者和新基因发现者。尽管存在组织特异性限制（如神经相关基因在血液低表达），但标准化流程仍成功识别出剪接异常、等位基因失衡等关键信息。特别值得注意的是，RNA-seq能捕捉到GS易遗漏的复杂变异（如Case 38中BBS1的转座子插入），并为CNV提供功能注释层。

随着更多儿科RNA-seq数据的积累，未来可建立更精确的基因表达参考区间，进一步提高诊断敏感性。该团队开发的半自动化流程已具备临床转化条件，建议作为ACMG变异解读指南的补充证据。对于GS阴性病例，结合长读长测序（如HiFi）与多组织转录组分析，或将进一步打开罕见病诊断的新局面。这项研究不仅提供了实用诊断策略，更启示我们：在基因组时代，RNA才是连接DNA变异与表型的"分子翻译官"。