O-GlcNAc糖基化调控转录因子DNA结合能力的全蛋白质组筛选研究

本研究通过创新的DNA探针下拉筛选技术，系统揭示了O-GlcNAc糖基化修饰对241种核蛋白（包括146个转录因子/辅因子）DNA结合能力的增强作用，首次在蛋白质组尺度定量解析了O-GlcNAc通过调控FOXA1等叉头框家族转录因子的染色质结合活性，进而重塑基因转录网络的分子机制，为表观遗传调控提供了新视角。

　　

在细胞生命活动的精密调控网络中，蛋白质的翻译后修饰如同分子世界的"密码"，其中O-连接β-N-乙酰葡萄糖胺（O-GlcNAc）修饰因其独特的动态可逆特性备受关注。这种广泛存在于核蛋白的修饰，通过仅由O-GlcNAc转移酶（OGT）和O-GlcNAc水解酶（OGA）构成的二元调控系统，像"分子开关"般调控着转录因子（TFs）的活性。然而长久以来，科学界面临一个关键难题：O-GlcNAc修饰如何在全蛋白质组尺度上精确调控转录因子与DNA的相互作用？这个问题的解答对理解基因表达调控和疾病发生机制至关重要。

来自大连理工大学的研究团队在《Scientific Reports》发表的研究中，开发了一种创新的串联转录因子响应元件（catTFREs）下拉筛选技术。通过将42个人类TF家族的DNA结合序列串联成长2.6kb的catTFRE-80探针，结合定量质谱分析，首次系统绘制了O-GlcNAc修饰水平波动下核蛋白-DNA互作的全景图谱。研究采用OSMI-1（OGT抑制剂）和Thiamet G（OGA抑制剂）处理MCF7细胞，构建低/高O-GlcNAc修饰状态的核蛋白组，通过竞争性结合实验和凝集素（sWGA）富集策略，定量解析了修饰程度与DNA结合能力的关联性。

设计并验证catTFREs用于TF下拉分析
研究团队设计的catTFRE-80包含42个TF家族的响应元件，通过Western blot验证其对FOXA1、FOXC1等转录因子的特异性捕获能力。qPCR分析显示，OGA抑制剂处理使FOXA1与catTFRE-80的结合效率提升3.2倍，而OGT抑制剂则降低其结合活性，证实O-GlcNAc修饰直接调控TF-DNA相互作用。

定量蛋白质组学揭示O-GlcNAc对蛋白-DNA互作的影响
通过无标记定量（LFQ）蛋白质组学，从5618个鉴定蛋白中筛选出2100个高置信度核蛋白，其中catTFRE-80可捕获90%的核蛋白（1721个）。与随机序列（RS）对照相比，521个核蛋白（含305个TFs/辅因子）被特异性富集。在O-GlcNAc水平变化条件下，237个核蛋白显示≥2倍的DNA结合能力差异。

O-GlcNAc增强大多数核蛋白的DNA相互作用
sWGA富集结合定量分析发现，Thiamet G处理组中309个核蛋白的O-GlcNAc修饰程度显著升高。相关性分析显示修饰程度与DNA结合能力呈强正相关（Pearson r=0.77）。值得注意的是，241个核蛋白在高O-GlcNAc状态下DNA结合能力增强，仅2个蛋白表现抑制效应。

O-GlcNAc增强叉头框家族TF的DNA结合
在634个O-GlcNAc修饰的TFs/辅因子中，159个在高修饰状态下DNA结合能力提升。叉头框家族成员FOXA1、FOXC1等6个TF的DNA结合活性与O-GlcNAc修饰程度显著正相关（r=0.82）。体外实验证实，原核表达的O-GlcNAc修饰型GST-FOXA1比未修饰型对catTFRE-80的结合能力提高4.7倍。

O-GlcNAc增强活细胞中FOXA1的染色质结合
通过分析22RV1前列腺癌细胞中FOXA1的ChIP-seq数据，发现其结合于HOXA9、HOXA10等基因的调控区。实验显示，野生型HA-FOXA1^WT在五个染色质位点的富集程度是糖基化缺陷突变体HA-FOXA1^3A的2.1-3.8倍，并显著激活HOXA基因簇表达，证实O-GlcNAc修饰通过增强TF-DNA互作调控下游转录程序。

这项研究建立了首个蛋白质组尺度的O-GlcNAc修饰-TF-DNA互作调控图谱，揭示了该修饰通过"分子胶水"机制增强TF-DNA结合的普遍规律。特别是发现叉头框家族转录因子受O-GlcNAc调控的保守性，为理解乳腺癌和前列腺癌等疾病中转录失调提供了新机制。技术层面创新的catTFREs下拉联合定量质谱策略，为表观遗传修饰的功能研究提供了普适性方法。未来研究可进一步探索O-GlcNAc与其他修饰（如磷酸化）的协同调控，以及在三维基因组层面的调控作用。