高通量无标记连续定量技术揭示肌肉干细胞增殖与分化的动态过程

本研究针对传统荧光标记法在肌肉卫星细胞(SCs)增殖和肌原性分化定量中的局限性，开发了一种基于高对比度明场(HCBF)成像的高通量无标记检测技术。通过优化BioTek Cytation 5成像系统参数，实现了96孔和384孔板中细胞增殖与肌管形成的连续动态监测。该技术成功应用于牛、猪卫星细胞的血清培养基优化，揭示了肌管二次形成等新现象，为培养肉生产和肌肉再生研究提供了高效筛查工具。

　　

在肌肉再生和培养肉生产领域，定量监测肌肉卫星细胞(SCs)的增殖和分化动态至关重要。传统荧光标记法虽然灵敏，但存在操作繁琐、终点检测、干扰肌管完整性等问题。更棘手的是，肌管形成具有高度动态性——它们会随机形成并从培养皿上脱落，这使得传统终点检测方法难以捕捉完整的生物学过程。这种技术瓶颈严重制约了肌肉疾病模型构建、药物筛选以及培养肉产业化进程。

针对这一挑战，奥胡斯大学食品科学系的研究团队在《Stem Cell Reviews and Reports》发表创新成果，开发出基于高对比度明场(HCBF)成像的高通量无标记检测技术。该技术通过优化商用BioTek Cytation 5成像系统参数，首次实现了在标准96孔和384孔板中对肌肉干细胞增殖和肌原性分化的连续动态定量，无需任何标记试剂或细胞操作。

研究团队主要采用三项关键技术：1）高对比度明场(HCBF)成像技术，通过调节z轴偏移实现不同细胞结构的特异性增强成像；2）自动化图像分析系统(Gen5软件)，对细胞增殖和肌管形成进行定量分析；3）多孔板动态培养体系，实现长达9天的连续监测。实验使用从荷斯坦牛犊和杜洛克杂交猪肌肉组织中分离的原代卫星细胞作为研究对象。

【Label-free Cell Counting in High-throughput Formats Using HCBF Imaging】
研究首先验证了HCBF细胞计数在高通量格式中的可靠性。通过比较Hoechst染色核计数与HCBF成像，发现在96孔板和384孔板中均呈现高度线性相关（R²>0.99）。特别值得注意的是，在384孔板格式中，当使用70μL培养基时，可获得80%的有效分析面积（7.13×10⁶μm²），为高通量筛查奠定了基础。

【Label-free Myotube Quantification in 96-well Format Using HCBF Imaging】
通过进一步增加z轴偏移（2070μm），研究实现了肌管特异性成像。与传统免疫荧光染色（肌球蛋白重链MHC和Phalloidin染色）相比，在血清培养基(SFM)中三种方法获得的肌管面积无显著差异。动态监测揭示了令人惊讶的现象——在含血清培养基(PGM)中，肌管会经历"形成-脱落-二次形成"的独特动力学过程，这在传统终点检测中极易被遗漏。

【Label-free Myotube Quantification in 384-well Format Using HCBF Imaging】
在384孔板优化实验中，研究发现Matrigel 1:10稀释度的涂层效果最佳，能显著减少肌管脱落。Erk抑制剂处理虽然初期减缓肌管形成，但最终使肌管面积增加45%（p=0.001），提示MAPK信号通路在肌管稳定性中的重要作用。不同厂家384孔板的比较显示，培养器材的机械特性会显著影响细胞行为。

【HCBF Imaging Highlights Cell Growth and Myo-kinetics of Porcine and First-Passage Bovine Satellite Cells】
跨物种比较显示，猪卫星细胞(PSCs)在血清培养基(SFM)中的肌管形成显著优于含血清培养基，且形态差异明显。首次传代(p1)的牛卫星细胞表现出与多次传代(p4)细胞不同的动力学特征——p1细胞在PGM中呈现典型的"双峰"肌管形成模式，这种精细的时序差异只有通过连续监测才能发现。

【High-throughput Label-Free Screening of Clonal Satellite Cell Populations】
研究最引人入胜的应用是单细胞水平的克隆筛查。通过0.85个细胞/孔的接种密度，在8天内观察到67%的孔形成肌管，其中部分克隆能完全覆盖孔底。这种高通量筛查为鉴定优质肌源性干细胞提供了新思路。

这项研究通过技术创新解决了肌肉生物学研究中的关键瓶颈问题。其核心价值在于：1）首次实现无标记、非侵入性的肌管形成连续定量；2）揭示肌管动态脱落后再生等新生物学现象；3）建立384孔板高通量筛查体系，为培养肉产业化提供质量监控工具；4）发现血清培养基在猪卫星细胞分化中的优势，提示物种特异性培养基优化的重要性。特别值得注意的是，该技术可直接应用于原代细胞研究，无需基因编辑，这对临床相关研究具有特殊价值。

技术层面，HCBF成像的巧妙之处在于将商用设备的现有功能重新参数化，使普通实验室也能轻松实现高时空分辨率的动态监测。这种方法学创新比开发全新设备更具推广价值。未来，结合深度学习算法，该技术平台有望在肌肉病理模型构建、药物筛选和培养肉工艺优化等领域发挥更大作用。正如作者指出，这项研究不仅推进了基础生物学认知，更为实现可持续的细胞农业提供了关键技术支撑。