单张小鼠FFPE肺组织切片的空间转录组与形态功能整合分析揭示肺纤维化的深度分子特征

本研究针对肺纤维化研究中新鲜组织样本稀缺且空间信息缺失的难题，创新性地采用单张10μm厚福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)小鼠肺切片，结合微CT成像和组织学分析，建立了空间导向的多组学整合研究范式。通过RNA测序(RNAseq)技术鉴定出2,534个差异表达基因(DEGs)，发现细胞外基质(ECM)重构和免疫炎症通路的关键作用，其与CT密度参数和Ashcroft评分高度相关。该研究为FFPE样本在转化医学研究中的应用提供了重要技术支撑，为肺纤维化精准诊疗提供了新型生物标志物筛选平台。

　　

肺纤维化作为呼吸系统难治性疾病，其发病机制复杂且临床缺乏有效治疗手段。传统研究面临两大瓶颈：一方面新鲜冻存组织(FF)样本难以长期保存且无法同步进行形态学分析；另一方面常规转录组分析丢失了关键的空间信息，而纤维化病灶在肺内分布具有显著异质性。针对这些挑战，来自Chiesi制药公司的Erica Ferrini团队创新性地提出"单切片多组学"研究策略，相关成果发表于《Respiratory Research》。

研究团队采用呼吸门控微CT、全自动深度学习分割算法和半自动配准技术，对博来霉素(BLM)诱导的小鼠肺纤维化模型进行纵向监测。从FFPE样本中同步获取5μm厚切片用于Masson's Trichrome(MT)染色和Ashcroft评分，10μm相邻切片用于RNA提取。通过SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v3构建文库，在Illumina NovaSeq 6000平台完成测序。与公共数据库GSE218997(FF样本)和GSE92592(IPF患者)进行跨物种比较。

【空间匹配与定量分析】通过深度学习算法将2D组织切片与微CT冠状面精准匹配，发现BLM组非通气区域(%Non)显著增加至16±11%(p=0.0127)，中重度纤维化区域占比达81±21%(p<0.0001)。样本B_8表现最严重病变，其%Non达35%，Ashcroft评分>5区域占75%。

【转录组特征解析】RNAseq鉴定出29,273个表达基因，与FF样本重叠率达90%。DEGs分析显示1,503个上调基因主要富集于ECM组织(Col1a1/3a1/4a2/5a2)、金属蛋白酶(Mmp13/2/Timp1)和炎症通路(Il1b/6/10ra,Ccl2/7,Cxcl5/9)。qPCR验证Col1a1表达增加5.8倍(p<0.01)，PicroSirius染色证实胶原沉积。

【分子-表型关联】无监督聚类将样本分为三组：Group1(对照)高表达蛋白合成基因；Group2(BLM)富集B细胞相关基因(IgA/M,Cd19/22)；Group3(BLM)特异性高表达ECM重构基因(Col1a2/28a1,Loxl3)和单核细胞趋化基因(Ccr2)。Group3的基因簇II表达与%Hypo+Non呈强相关(r=0.925,p<0.001)。

【跨物种验证】37%的小鼠DEGs在IPF患者中存在人类同源基因，其中68%呈现相同表达趋势，包括TGF-β通路成员(Tgfb3r,Smad1)和基质金属蛋白酶(Mmp11/13/14)。

该研究建立了FFPE样本的空间多组学研究新范式，证实单张肺切片可同时获取转录组、组织学和影像学数据。研究发现ECM重构基因簇与CT密度参数的高度相关性，为无创影像学生物标志物开发提供分子基础。特别值得注意的是，Fkbp10和Ccr2等基因的差异表达模式，为肺纤维化的分期诊疗提供了潜在靶点。这种整合分析方法可推广至COPD等其他肺疾病研究，对推动精准医学发展具有重要意义。