Gαo通过GoLoco/GPR基序调控Rap1GAP1的分子机制及其在Gαo脑病突变体中的功能破坏

本研究通过邻近标记蛋白质组学技术揭示了Gαo-GTP新型效应蛋白Rap1GAP1的调控机制，发现其不同剪接变体通过GoLoco/GPR基序差异识别Gαo核苷酸结合状态，并证实GNAO1脑病相关突变会破坏该功能互作，为阐明神经发育障碍的分子机制提供了新见解。

　　

在神经系统中，G蛋白偶联受体(GPCR)及其下游的G蛋白信号传导系统扮演着至关重要的角色。其中，Gα_o作为大脑中最丰富的G蛋白α亚基，其功能异常与多种神经发育障碍密切相关。然而，四十年来科学家们对Gα_o的直接效应蛋白知之甚少，这严重限制了对相关疾病机制的理解。尤其令人困惑的是，编码Gα_o的GNAO1基因突变会导致严重的神经发育性癫痫脑病，但具体的致病机制仍不清楚。

为破解这一科学难题，研究人员采用创新的邻近标记蛋白质组学技术TurboID，在分化的PC12细胞中系统筛选Gα_o的相互作用蛋白。通过比较野生型Gα_o和持续激活突变体Gα_o^(Q205L)的互作组差异，研究人员发现Rap1GAP1是Gα_o-GTP最显著富集的候选效应蛋白。这一发现颇具突破性，因为既往研究对Rap1GAP是否真正作为Gα_o效应蛋白存在巨大争议——有报道称其优先结合Gα_o-GDP，也有研究认为其与Gα_o完全不结合。

研究团队运用多种前沿技术手段，包括纳米荧光素酶互补分析(NanoBiT)、增强旁观者BRET(ebBRET)和RalGDS膜转位检测系统等，深入解析了Rap1GAP1与Gα_o的互作机制。这些创新方法的应用，使得研究人员能够在接近生理条件下捕捉G蛋白与效应蛋白之间动态、瞬时的相互作用。

研究结果部分包含多项重要发现：

在"邻近标记揭示多个潜在的Gα_o信号互作伙伴"部分，通过TurboID-Gα_o的蛋白质组学筛选，鉴定出116个Gα_o^(Q205L)富集蛋白和193个Gα_o^(WT)富集蛋白。基因本体分析显示Gα_o^(Q205L)靶标显著富集于高尔基体和囊泡运输相关通路，而Gα_o^(WT)靶标则更多定位在质膜和细胞质。

在"Rap1GAP1优先与活性Gα_o相互作用"部分，通过免疫共沉淀和NanoBiT实验证实Rap1GAP1a特异性结合Gα_o-GTP而非Gα_o-GDP。这一结果与既往认为GoLoco/GPR基序仅识别Gα-GDP的传统认知形成鲜明对比。

在"Gα_o选择性招募Rap1GAP1a至质膜"部分，ebBRET实验显示Gα_o^(Q205L)能显著促进Rap1GAP1a向质膜转位，而Gα_o^(WT)无此效应。μ阿片受体(MOR)激活后，这一转位过程可被百日咳毒素(PTX)阻断，证实其依赖G_i/o蛋白信号。

在"Rap1GAP1的N端区域是Gα_o的选择性模块"部分，通过构建系列缺失突变体，发现Rap1GAP1a的截短型GoLoco/GPR基序（缺失N端7个氨基酸）是其识别Gα_o-GTP的关键决定因素。而含有完整GoLoco/GPR基序的Rap1GAP1b变体则保持对Gα_o-GDP的偏好性结合。

在"Gα_o调控质膜上Rap1GAPa的活性"部分，创新性地开发了RalGDS-RlucII报告系统，首次在活细胞中实时监测到Gα_o通过招募Rap1GAP1a至质膜抑制Rap1活性的动态过程。这一调控严格依赖Rap1GAP1a的GoLoco/GPR基序。

在"GNAO1致病突变体阻碍Gα_o-效应蛋白相互作用"部分，研究发现GNAO1脑病相关热点突变（如G203E、R209H和E246G）虽能正常解离Gβγ，却无法有效结合Rap1GAP1a或调节其活性，提示这些突变可能通过破坏Gα_o-效应蛋白互作导致疾病。

这项发表在《Journal of Biological Chemistry》上的研究具有多重重要意义：首先，它首次阐明了Rap1GAP1作为Gα_o效应蛋白的分子机制，解决了该领域长期存在的争议；其次，发现截短型GoLoco/GPR基序可介导Gα-GTP特异性识别，拓展了对这一经典基序功能的认识；最重要的是，研究揭示了GNAO1脑病突变破坏Gα_o-效应蛋白互作的新致病机制，为开发针对性治疗策略提供了分子靶点。这些发现不仅深化了对G蛋白信号转导的理解，也为相关神经发育障碍的精准诊疗奠定了理论基础。