单细胞测序联合转录组解析瓣膜间质细胞(VICs)在钙化性主动脉瓣疾病(CAVD)中的分子机制

本研究针对钙化性主动脉瓣疾病(CAVD)的发病机制不明问题，通过整合GSE51472/GSE235995/GSE12644数据集和单细胞测序数据，发现VICs通过MMP1/MMP9/ROBO1调控脂代谢-炎症-ECM重塑网络驱动CAVD进展。研究首次揭示VICs亚群（iVIC/aVIC/sVIC/liVIC）的时空异质性，为靶向干预提供新策略。

　　

钙化性主动脉瓣疾病(CAVD)正成为威胁全球老龄人群的"沉默杀手"——这种起病隐匿的瓣膜病变从早期硬化到终末期狭窄往往历经数十年，当患者出现明显症状时，约50%会在两年内死亡。更棘手的是，现有他汀类药物和抗钙化疗法在临床试验中屡屡受挫，外科换瓣手术仍是唯一有效却风险较高的选择。这种临床困境的核心在于CAVD的分子机制尚未阐明，特别是瓣膜间质细胞(VICs)如何响应异常血流剪切力和代谢压力，通过表型转化驱动瓣叶纤维钙化病变的精确机制仍属未知。

为破解这一难题，研究人员开展了一项融合多组学技术的创新研究。团队首先从GEO数据库获取GSE51472(5病例/5对照)、GSE235995(5病例/4对照)和GSE12644(10病例/10对照)三组转录组数据，结合单细胞测序数据(2对照/4病例)展开系统分析。通过差异表达基因(DEGs)筛选、GO/KEGG功能富集、蛋白互作网络(PPI)构建、单细胞亚群注释及伪时序轨迹分析等关键技术，揭示了VICs在CAVD中的核心作用机制。

3.1 转录组差异分析
PCA分析证实样本分组合理性，在GSE51472和GSE235995数据集中分别鉴定出674和2569个DEGs。交集分析锁定205个CAVD相关基因(60上调/145下调)，这些基因显著富集于细胞膜粘附、ECM组织等生物学过程，以及Wnt信号、AGE-RAGE等通路。

3.3 单细胞注释
通过Seurat和Harmony整合分析，细胞被分为VICs、瓣膜内皮细胞(VEC)和免疫细胞三大类。值得注意的是，CAVD组VICs比例显著增高，提示其可能作为"疾病枢纽细胞"发挥作用。

3.4 VICs差异分析
VICs中鉴定出2280个DEGs(437上调/1843下调)，功能分析显示这些基因与凋亡、脂代谢、细胞衰老等过程密切相关。特别是发现iVIC(炎症型)、aVIC(增殖型)、sVIC(应激型)和liVIC(脂代谢型)四个功能亚群，为理解CAVD异质性提供新视角。

3.5 关键基因筛选
通过单细胞与转录组数据交叉验证，最终锁定MMP1、MMP9、ROBO1三个核心基因。外部数据集验证显示：CAVD组MMP1/9表达显著升高，而ROBO1表达降低。PPI网络分析表明这些基因构成紧密互作模块，可能通过协同作用影响CAVD进程。

3.8 伪时序分析
Monocle2分析揭示VICs分化轨迹存在组间差异——CAVD样本富含早期分化阶段的liVIC和iVIC，而对照组以终末分化VICs为主。基因表达热图显示MMP1/9在分化中后期高表达，ROBO1则在早期活跃，暗示它们可能调控不同的病理阶段。

这项研究的重要发现在于构建了"脂代谢-炎症-ECM重塑"的CAVD发病机制模型：异常血流剪切力导致VICs中ROBO1表达下调，解除其对MMP1/9的抑制作用；升高的MMP1/9一方面降解ECM暴露促钙化位点，另一方面通过NF-κB通路放大炎症反应；同时，ox-LDL等脂毒性物质通过正反馈循环进一步激活MMPs，最终形成"炎症-钙化"恶性循环。

特别值得注意的是，研究发现MMP1可能作为关键分子节点整合多重病理信号——它既能被ox-LDL诱导表达，又可降解胶原释放隐藏的促炎因子，还能通过破坏ECM稳定性直接促进钙盐沉积。这解释了为何单纯降脂治疗在CAVD中效果有限，也为开发同时靶向脂代谢和MMPs的联合疗法提供理论依据。ROBO1的发现则开辟了新研究方向，其作为SLIT-ROBO信号通路受体，可能通过调控血管新生参与CAVD微环境重塑。

该研究的临床意义在于：首次通过单细胞分辨率解析CAVD中VICs的功能异质性，为开发亚群特异性治疗策略奠定基础；鉴定的MMP1/9和ROBO1不仅可作为疾病进展的生物标志物，更是潜在的治疗靶点；提出的"多靶点协同干预"策略，为突破当前CAVD药物治疗瓶颈提供新思路。未来研究需在动物模型中验证这些靶点的调控效果，并探索其与现有抗钙化药物的协同作用机制。