镁离子-ATP复合物在萤火虫荧光素酶催化活化中的双功能机制：QM/MM分子动力学研究

本研究通过QM/MM分子动力学模拟，揭示了萤火虫荧光素酶(FLuc)中MgATP结合的双重催化机制：不仅参与荧光素腺苷酸化，还通过稳定去质子化中间体促进反应。研究首次提出P-loop样结构(Gly524-Lys528)介导MgATP结合，并阐明PPi4-作为质子受体的新角色，为理性设计生物发光系统提供理论基础。

　　

萤火虫生物发光现象因其超高发光效率成为生物医学检测的重要工具，但其核心酶——萤火虫荧光素酶(FLuc)的催化机制仍存在关键谜团。尽管已知FLuc需依赖ATP和镁离子(Mg²⁺)催化荧光素(Luciferin)发光，但长期以来，MgATP的结合位点、去质子化过程的质子受体等分子细节尚未阐明，这严重阻碍了人工改造荧光素酶的性能。更棘手的是，传统认为催化关键残基His244突变后仍保留20%活性的现象，暗示着存在未知的替代机制。

针对这些挑战，俄罗斯科学基金支持的研究团队通过多尺度计算模拟技术，首次系统揭示了MgATP在FLuc中的双功能催化机制。研究采用经典分子动力学(MD)、量子力学/分子力学(QM/MM)以及QM/MM自由能计算等方法，构建了FLuc-荧光素-ATP-Mg²⁺复合物模型。关键技术包括：基于PDB 6k4d晶体结构的体系构建、AMBER力场的经典MD优化、B3LYP/6-31G*水平的QM/MM计算，以及元动力学(metadynamics)自由能模拟。

Positioning of MgATP in the enzyme-substrate complex
研究发现FLuc的Gly524-Lys528环具有典型P-loop特征，能通过Mg²⁺桥接ATP磷酸基团与蛋白主链，这种结合模式与经典ATP/GTP结合蛋白高度相似。QM/MM模拟显示，Mg²⁺通过协调ATP三磷酸氧原子和Thr526主链羰基氧，显著降低腺苷酸化能垒。

Conclusion
研究证实MgATP在FLuc中具有双重功能：作为底物参与荧光素腺苷化后，其衍生的焦磷酸(PP_i^4-)能作为质子受体，通过两种途径完成去质子化——直接由His244传递质子，或在其突变时通过水分子链间接传递。这解释了His244突变体保留活性的现象。

该研究不仅首次阐明FLuc中MgATP结合的原子机制，更创新性地提出PP_i介导的质子转移通路，为理解生物发光分子开关提供了全新视角。发表于《Molecular Catalysis》的这项成果，对开发新型生物发光探针和优化酶工程策略具有重要指导价值。