基于免疫信息学的多表位疫苗设计：靶向肺炎克雷伯菌与鲍曼不动杆菌共感染的创新策略

本研究针对临床中日益严重的多重耐药(MDR)肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)与鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)共感染问题，采用反向疫苗学(reverse vaccinology)结合免疫信息学(immunoinformatics)方法，成功设计出包含6个CTL表位、6个HTL表位和6个B细胞表位的多表位疫苗。通过分子对接证实其与TLR4(-13.5 kcal/mol)和HLA-A*11:01(-13.1 kcal/mol)的强结合力，免疫模拟显示可诱导Th1/Th2型免疫反应，为应对ESKAPE病原体共感染提供了新型疫苗候选方案。

　　

在抗生素失效的时代，医院病房里正上演着一场无声的战争——多重耐药(MDR)的"超级细菌"让现代医学束手无策。世界卫生组织(WHO)警告，到205年这些耐药菌可能导致每年1000万人死亡，其中ESKAPE病原体中的肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)和鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)尤为凶险。中国抗菌药物监测网数据显示，肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素的耐药率持续攀升，而鲍曼不动杆菌的耐药率五年间始终高于70%。这两种病原体形成的"致命联盟"能通过协同作用增强生物膜形成，导致比单一感染更严重的临床后果，但针对这种共感染的防治手段仍是空白。

为应对这一挑战，来自中国的研究团队在《BMC Infectious Diseases》发表了一项突破性研究。他们采用计算机辅助的"反向疫苗学"策略，从两种细菌的6种表面蛋白(Wza、IutA、Pal、FilF、OmpA、PilA)入手，通过免疫信息学方法设计出新型多表位疫苗。这项研究创新性地将两种病原体的共同弱点作为靶点，为开发广谱抗菌疫苗提供了新思路。

研究人员运用了以下关键技术：1)通过NetCTLpan 1.1和IEDB工具预测T/B细胞表位；2)采用GPGPG和EAAAK连接子构建多表位疫苗；3)利用trRosetta和GalaxyRefine进行三级结构建模；4)通过HADDOCK 2.4进行TLR4和HLA-A*11:01分子对接；5)使用GROMACS进行50 ns分子动力学模拟；6)借助C-IMMSIM进行免疫反应模拟。所有蛋白数据来源于毒力因子数据库(VFDB)，人群覆盖率分析基于IEDB数据库的全球HLA分布数据。

【蛋白质序列检索与评估】
研究首先从VFDB和UniProt获取6种关键蛋白序列，经VaxiJen评估抗原性(均>0.5)，PSORTb定位显示多数为外膜蛋白，AllerTOP和Toxinpred证实其无过敏性和毒性。这些蛋白在两种病原体的致病性和耐药性中发挥核心作用，如Wza参与荚膜输出，OmpA影响药物渗透。

【B细胞表位预测】
通过IEDB和BCPREDS筛选出6个线性B细胞表位(8-26个氨基酸)，DiscoTope 2.0预测构象表位。图2展示的三维模型显示，疫苗能形成6个不连续表位区域，最高得分达0.774，这些表位将为抗体识别提供多重靶点。

【T细胞表位筛选】
NetCTLpan预测的CTL表位和HTL表位均能结合多种HLA超型，如MVLGTEFQL可结合HLA-B*15:01等5种MHC-I分子。特别筛选出能刺激IFN-γ、IL-2等关键细胞因子的表位，如表4所示，GTEFQLQPYDIVYV能通过HLA-DRB1 * 15:01诱导Th1/Th2混合反应。

【多表位疫苗构建】
疫苗设计如图3所示，将表位通过GPGPG柔性连接子串联，N端添加PADRE佐剂序列，C端加入His标签。最终构建体含208个氨基酸，分子量21.48 kDa，ProtParam分析显示其不稳定指数仅18.17，Solprot评分0.682证实高溶解性。VaxiJen评分1.1856证实强抗原性，且无毒性过敏风险。

【二硫键工程与结构优化】
通过Disulfide by Design引入4对二硫键(如Asn110-Val116)，使疫苗结构更稳定。PSIPRED预测二级结构含48.56%无规卷曲，赋予结构灵活性。三级结构经trRosetta建模后，Ramachandran图显示89.7%残基位于最优区(图5C)，ProSA Z-score从-4.11提升至-5.23。

【分子对接与动力学】
疫苗与TLR4形成16个氢键和148个非键接触(图6)，结合自由能-13.5 kcal/mol。与HLA-A*11:01形成13个氢键和3个盐桥(图7)，MM-PBSA计算净结合能-508.0 kJ/mol。50 ns分子动力学显示复合物RMSD在10 ns后稳定在0.8 nm内(图8)，Rg值下降表明结构逐渐紧缩。

【免疫模拟与表达优化】
C-IMMSIM模拟显示疫苗能诱导IgG滴度达1.6×10⁵(图10A)，激活750个B细胞/mm³和9500个Th细胞/mm³。JCAT优化后CAI值0.58，GC含量62.5%，成功克隆至pET28a(+)载体(图9)，预示在大肠杆菌中可高效表达。

这项研究通过计算生物学手段，首次设计出针对肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌共感染的多表位疫苗。其创新性体现在：1)同时靶向两种ESKAPE病原体的保守表位；2)结构优化使疫苗稳定性显著提升；3)覆盖全球96.83%人群的HLA类型；4)计算机预测能诱导强Th1型反应。虽然需要后续实验验证，但该疫苗设计为应对耐药菌感染提供了新思路，其模块化设计策略也可拓展至其他病原体组合。随着抗生素失效危机加剧，这类基于免疫信息学的精准疫苗设计，或将成为感染防控的重要突破口。