揭示snRNA核输出复合体的协同组装机制：PHAX磷酸化介导的CBC-CRM1-RanGTP三元结构解析

本研究通过冷冻电镜技术解析了人类snRNA核输出复合体的高分辨率结构，揭示了磷酸化PHAX蛋白如何协同桥接核帽结合复合体(CBC)与输出因子CRM1-RanGTP的分子机制。研究发现PHAX通过多价相互作用稳定复合体组装，其磷酸化修饰不仅增强复合体稳定性，还能竞争性取代ARS2蛋白，为理解RNA命运决定机制提供了结构基础。该成果发表于《Nature Structural & Molecular Biology》，为靶向核输出通路的药物开发提供了新思路。

　　

在真核细胞中，RNA聚合酶II(Pol II)转录产生的大量RNA需要被精确分选——功能性RNA如小核RNA(snRNA)需被选择性输出至细胞质，而异常转录本则被降解。这一过程的核心调控者是核帽结合复合体(CBC)，它能识别m⁷G-cap结构并通过动态结合不同效应因子决定RNA命运。其中，磷酸化RNA输出适配体(PHAX)介导的snRNA输出途径已发现25年，但其分子机制始终未明。主要问题在于：PHAX如何协调CBC与输出受体CRM1的相互作用？磷酸化修饰如何调控这一过程？ARS2蛋白在复合体组装中扮演什么角色？

为回答这些问题，欧洲分子生物学实验室(EMBL)的Etienne Dubiez等研究人员通过冷冻电镜解析了2.45 ?分辨率的人源snRNA输出复合体结构，该复合体包含磷酸化PHAX、CBC、CRM1-RanGTP和带帽RNA。研究发现PHAX通过多区域协同作用形成"分子桥梁"：其C端螺旋(W118区域)结合CBP80，核输出信号(NES)结合CRM1，而N端57-YR基序与CRM1远端结合，使相邻磷酸化ST2簇(Ser64-76)能够与RanGTP的碱性表面相互作用。这种"多点锚定"机制不仅增强了复合体稳定性，还通过PHAX140-162区域与RNA帽结构的特异性结合实现了输出承诺。研究还发现CBC-PHAX-CRM1的组装会竞争性排斥ARS2和ALYREF等效应因子，为理解RNA分选提供了结构基础。该成果发表于《Nature Structural & Molecular Biology》。

关键技术方法包括：1)利用昆虫细胞和原核表达系统制备复合体各组分；2)体外CK2激酶催化的PHAX磷酸化及质谱验证；3)凝胶过滤和质谱光度法分析复合体组装；4)冷冻电镜数据收集与处理(采用Krios和Glacios电镜)；5)基于AlphaFold预测指导模型搭建；6)小鼠胚胎干细胞(ES-E14TG2a)的基因编辑和邻近标记实验验证体内相互作用。

PHAX介导CBC与CRM1的相互作用
研究发现PHAX117-136形成长螺旋同时结合CBC和CRM1：其C端NES(含非经典Q127)插入CRM1疏水口袋，而N端W118插入CBP80保守口袋。与单独CBC-PHAX复合体相比，输出复合体中PHAX与CBP80新增了3对氢键(N115-S429等)。CBP20也直接与CRM1形成氢键网络(Y142-K563等)，共同稳定复合体。关键突变实验显示，PHAX W118E突变完全破坏复合体形成，邻近标记实验证实小鼠PHAX W108A(对应人W118)突变导致CRM1-Ran招募完全丧失。

PHAX深度参与RNA帽识别
结构显示PHAX140-162通过E150与CBP20关键残基(R112/Y43)形成氢键，增强m⁷G识别。更关键的是，PHAX R147和Y154将第一个转录核苷酸(A1)从CBP20 Y138处"撬出"，形成π-π堆叠和氢键网络。等温滴定量热法(ITC)证实CRM1-RanGTP存在时，PHAX才贡献帽结合能力——单独CBC对m⁷GpppG的K_d=96 nM，而加入PHAX103-196后亲和力不变；但Y154A突变即导致复合体解离，说明PHAX-RNA相互作用对CRM1招募至关重要。

PHAX磷酸化的结构基础
质谱鉴定出ST2簇(64-DSSEESFSDSDDD)含4个磷酸化位点。冷冻电镜图中，PHAX55-60(含保守YR motif)结合CRM1 HEAT5-6间的酸性口袋，使相邻磷酸化ST2可能以"模糊"方式与RanGTP碱性表面(K99/K132等)相互作用。小鼠实验中，ST2磷酸化位点突变(mS56A-S57A-S60A-S63A)显著降低CRM1-Ran招募，说明该相互作用对复合体稳定性至关重要。有趣的是，Ran碱性表面在tRNA/pre-miRNA输出复合体中直接结合RNA，而snRNA复合体中该表面被磷酸化PHAX占据，可能防止非特异性RNA竞争。

ARS2从CBC中被PHAX置换
凝胶过滤实验显示，当PHAX103-196(缺乏N端ARS2识别基序ARM)与CBC-ARS2竞争时，无法形成输出复合体；而全长PHAX可通过其ARM(9-EDGQL-13)同时结合ARS2效应结构域和CBC，最终将ARS2 C端从CBP20-CBP80沟槽中置换出来。ARM突变体(PHAX E9R)虽仍能形成输出复合体，但ARS2结合显著减少，说明PHAX-CBC的强化相互作用是ARS2解离的主因。邻近标记实验证实，PHAX ARM突变不影响核心复合体组装，说明ARS2可能主要作为"守门员"防止CBC过早结合PHAX。

这项研究首次完整揭示了snRNA输出复合体的组装原理：PHAX通过"诱导拟合"机制，在CRM1-RanGTP和带帽RNA存在时发生构象变化，形成稳定的三元复合体。其重要意义在于：1)阐明磷酸化修饰通过多价相互作用增强复合体特异性的结构基础；2)揭示RNA效应因子竞争CBC结合面的分子细节，为理解Pol II转录本命运决定提供范式；3)发现RanGTP碱性表面的多功能性——既能直接结合RNA(tRNA/pre-miRNA)，又能识别磷酸化适配体(snRNA)；4)为靶向核输出通路的药物设计(如CRM1抑制剂)提供新思路。该研究还提出若干待解问题：hnRNP C如何取代PHAX调控mRNA输出？UAP56/ALYREF如何协调PHAX功能？这些发现将推动对RNA代谢调控网络的深入探索。