金黄色葡萄球菌细胞壁重构增强金属螯合剂抗性机制研究

本研究针对抗生素耐药性危机，探索了金属螯合剂作为替代疗法的潜力。研究人员通过实验进化获得耐EDTA和DTPMP的金黄色葡萄球菌突变株，发现细胞壁增厚、肽聚糖交联减少和磷壁酸D-丙氨酸修饰改变等共同构成抗性机制。关键发现表明细胞壁可作为金属离子储存库抵抗营养免疫，为开发靶向金属稳态的抗菌策略提供新思路。论文发表于《npj Antimicrobials and Resistance》。

　　

在抗生素耐药性威胁全球公共卫生的背景下，寻找新型抗菌策略迫在眉睫。金属离子是病原体生存必需的关键营养素，宿主通过"营养免疫"机制限制病原体获取金属离子。金属螯合剂模拟这一过程，通过螯合铁、锰等必需金属发挥抗菌作用。然而，细菌如何进化出对金属螯合剂的抗性机制尚不清楚，这直接关系到此类药物的开发前景。

英国杜伦大学Gary J. Sharples团队联合德国、美国等多国研究人员，以临床重要病原体金黄色葡萄球菌为模型，通过实验进化获得耐乙二胺四乙酸(EDTA)和二乙烯三胺五亚甲基膦酸(DTPMP)的突变株。研究发现这些突变株通过重构细胞壁结构增强抗性，相关成果发表在《npj Antimicrobials and Resistance》。

研究采用实验进化、全基因组测序、透射电镜、肽聚糖组分分析、金属含量测定等关键技术方法。通过连续传代培养筛选抗性突变株，结合基因组分析鉴定关键突变位点；利用透射电镜观察细胞壁形态变化；采用高效液相色谱分析肽聚糖交联程度；通过电感耦合等离子体质谱测定细胞内金属含量变化。

【Isolation of chelator-resistant mutants of S. aureus】
研究人员通过15-29天的连续传代培养，从金黄色葡萄球菌FDA209P中分离出5株对EDTA和DTPMP产生交叉抗性的突变株。有趣的是，对EDTA产生抗性的菌株同时对DTPMP产生抗性，反之亦然，暗示存在共同抗性机制。

【Whole genome sequencing and identification of mutations in resistant strains】
全基因组测序揭示所有突变株均在青霉素结合蛋白2(PBP2)基因发生突变。EDTA抗性株携带跨膜螺旋区L53F突变，而DTPMP抗性株的突变集中在糖基转移酶(GTase)活性位点附近。此外，EDTA抗性株均出现fmtA基因无义突变，DTPMP抗性株JN208则发生vraF基因功能缺失突变。

【Reduced peptidoglycan cross-linking and increased cell wall thickness in mutants】
透射电镜显示突变株细胞壁显著增厚，平均厚度从野生型的23.55 nm增至30-32 nm。肽聚糖分析表明所有突变株交联度降低，单体、二聚体和三聚体比例增加，其中DTPMP抗性株变化更显著。细胞分裂异常现象也更为常见。

【Influence of PBP2 mutations on susceptibility to moenomycin and osmotic stress】
PBP2突变导致表型异质性：EDTA抗性株对莫能菌素(moenomycin)敏感性不变但耐盐性增强；DTPMP抗性株则对莫能菌素更敏感且耐盐性降低。这与美国300菌株中PBP2突变可补偿Δ0957菌株盐敏感性的发现一致。

【Altered mutant susceptibility to cell-wall targeting agents and changes in surface charge】
细胞表面电荷测定显示，fmtA或vraF缺陷株表面负电荷增加，与磷壁酸D-丙氨酸含量降低相关。EDTA抗性株对Triton X-100更敏感，DTPMP抗性株则对溶葡萄球菌素(lysostaphin)敏感性增加，反映不同突变对细胞壁结构的差异化影响。

【Metal content of chelator-resistant mutants】
关键发现是fmtA和vraF缺陷株细胞内钙含量增加4-5倍。EDTA洗涤实验表明约50%的钙位于细胞表面。两种螯合剂均优先消耗锰元素，对铁、锌影响较小。突变株能更好地维持锰水平，可能与增厚的细胞壁提供更多金属结合位点有关。

【Contribution of fmtA and vraF null mutants to the observed phenotypes】
构建的USA300 fmtA和vraF敲除株重现了抗性表型，证实这些基因缺失足以增强对螯合剂的抗性。这些突变株同样表现出表面负电荷增加和D-丙氨酸含量降低的特征。

【Chelator-selected mutants are not resistant to calprotectin】
值得注意的是，所有突变株对宿主免疫蛋白钙卫蛋白(calprotectin, CP)仍保持敏感，提示小分子螯合剂与蛋白质类金属螯合剂的抗菌机制存在差异。

研究结论揭示金黄色葡萄球菌通过多途径重构细胞壁抵抗金属螯合剂：PBP2突变导致细胞壁增厚和肽聚糖交联减少；fmtA和vraF缺陷改变磷壁酸修饰，增加表面负电荷和钙离子结合能力。这些变化使细胞壁成为关键的金属离子储存库，特别是钙离子的积累可部分补偿锰的流失。该发现阐明了革兰氏阳性菌抵抗金属限制的新机制，为开发靶向细胞壁金属稳态的抗菌策略提供了理论依据。

研究意义在于：首次系统揭示金黄色葡萄球菌对金属螯合剂的抗性机制；发现细胞壁作为金属缓冲池的生理功能；阐明磷壁酸修饰与金属稳态的关联性。尽管突变株表现出生长缺陷等适应性代价，但研究提示需警惕临床使用亚抑制浓度金属螯合剂可能诱导耐药的风险。这些发现为优化金属螯合剂与其他抗菌剂的联合应用策略提供了重要参考。