CRISPR-Cas9靶向纳米孔测序技术Context-Seq揭示肯尼亚内罗毕地区人与动物间抗菌素耐药性(AMR)传播动态

本研究针对抗菌素耐药性(AMR)传播机制不清的难题，开发了CRISPR-Cas9靶向纳米孔测序技术Context-Seq，通过富集blaCTX-M和blaTEM耐药基因及其基因组环境，首次在肯尼亚内罗毕家庭环境中发现人类(成人与儿童)与家禽、犬类之间存在遗传相似的AMR元件共享。研究鉴定出23个耐药基因簇，揭示ESBLs(超广谱β-内酰胺酶)基因通过质粒和染色体在不同宿主间传播的分子流行病学特征，为制定One Health(全健康)策略控制AMR传播提供了重要技术支撑。

　　

抗菌素耐药性(AMR)已成为威胁现代医学发展的全球性挑战，2019年全球约500万死亡病例与细菌耐药性相关。这一危机在低收入国家尤为严峻，抗生素滥用、卫生设施不足等因素加速了耐药基因的传播。传统研究方法如全基因组测序(WGS)受限于培养偏差，而宏基因组测序对低丰度靶标检测效率低下。如何精准追踪耐药基因在人类、动物和环境间的传播路径，成为破解AMR传播动态的关键科学问题。

针对这一挑战，来自美国的研究团队在《Nature Communications》发表了创新性研究成果。他们开发了名为Context-Seq的CRISPR-Cas9靶向纳米孔测序技术，通过选择性富集临床重要的bla_CTX-M和bla_TEMβ-内酰胺酶基因及其基因组环境，结合长读长测序优势，成功绘制了肯尼亚内罗毕地区家庭环境中AMR的传播图谱。研究发现人类与家禽、犬类之间存在广泛的耐药基因共享现象，并首次在家庭环境中鉴定出流感嗜血杆菌作为耐药基因的新宿主，为理解AMR的跨物种传播机制提供了全新视角。

关键技术方法包括：1)基于CHOPCHOP软件设计sgRNA并开发定制化脱靶效应预测工具；2)优化Cas9富集流程，引入热不稳定蛋白酶K消化步骤提升效率；3)使用Oxford Nanopore MinION平台进行长读长测序；4)对肯尼亚4个家庭的人类(成人和儿童)、家禽和犬类粪便样本进行跨物种比较分析。

样本和ARG靶标选择
通过TaqMan阵列卡预筛，从内罗毕7个家庭采集的粪便样本中选定高丰度的bla_TEM和bla_CTX-M Group 1作为靶标。这些基因在ESBLs中具有重要临床意义，bla_CTX-M能赋予对大多数β-内酰胺类药物的耐药性。

gRNA设计工具
开发了定制化算法评估gRNA在复杂微生物群落中的脱靶活性，选择靠近基因末端的切割位点以最大化捕获基因组环境。针对bla_TEM的guides虽非预测最优，但实验证实其富集效果显著。

方案优化
关键改进包括：1)分步切割sense/antisense链后合并文库；2)添加热不稳定蛋白酶K消化Cas9提升连接效率；3)确定双靶标富集会降低灵敏度。最终方案使目标基因覆盖度较非靶向方法提高7-15倍。

主要研究发现
在13份粪便样本中鉴定出平均长度4.8kb的耐药基因片段，包含转座酶(tnpA)、噬菌体基因等移动遗传元件(MGEs)。通过plasX分析发现bla_TEM和bla_CTX-M既存在于质粒也存在于染色体，主要宿主为大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和流感嗜血杆菌。与培养分离方法相比，Context-Seq在2个样本中额外检出耐药基因，证明其克服了培养偏差。

跨宿主传播证据
鉴定出23个共享基因簇(22个bla_TEM，1个bla_CTX-M)，其中11个在人类与动物间共享，11个在动物间共享。bla_CTX-M簇在3个家庭的犬类与家禽间传播，bla_TEM则通过不同遗传元件(质粒/染色体)在宿主间转移。值得注意的是，约50%共享发生在相距3公里的不同社区家庭间，暗示AMR传播具有广域性特征。

讨论与意义
该研究突破了传统方法的局限性：1)首次在家庭尺度揭示非大肠杆菌宿主(如流感嗜血杆菌)在AMR传播中的作用；2)证实动物-动物传播(特别是家禽-犬类)是重要但被忽视的传播途径；3)发现bla_TEM多与非ESBL型等位基因(如TEM-141/135)相关，而bla_CTX-M与CTX-M-15样基因相关。

研究提出的Context-Seq技术为AMR监测提供了新范式，其优势在于：1)无需培养即可获得宿主信息；2)长读长保留基因组环境信息；3)可扩展至其他耐药基因研究。作者建议未来研究应纳入环境样本，并探索多重样本检测方案以降低成本。这些发现为制定基于One Health框架的AMR防控策略提供了分子流行病学依据，特别是在抗生素使用监管薄弱的发展中国家具有重要意义。