单个主链氢键对维持GABAA受体关闭状态的关键作用及其在神经疾病中的机制研究

本研究通过非经典氨基酸(ncAA)技术，首次揭示β2亚基M2-M3连接区的主链氢键(H-bond)是抑制GABAA受体(GABAAR)孔道开放的关键"分子门闩"。该氢键断裂贡献了GABA激活能量的1/3，为癫痫、自闭症等神经精神疾病的药物靶点设计提供了新思路。

　　

在神经系统中，GABAA受体(GABA_AR)作为最重要的抑制性神经递质受体，其功能异常与癫痫、自闭症谱系障碍、精神分裂症等重大疾病密切相关。虽然近年来冷冻电镜技术已解析出该受体的三维结构，但关于其孔道门控的分子机制仍存在关键空白。特别值得注意的是，受体中连接跨膜区M2-M3螺旋的柔性连接区被认为在信号转导中起关键作用，然而这些无序区域的结构动态特征及其功能贡献仍难以捕捉。

德克萨斯大学奥斯汀分校和瑞典皇家理工学院的研究团队在《Nature Communications》发表突破性成果，首次证明β2亚基M2-M3连接区的一个主链氢键(Ile275:N-Pro273:O)是维持受体关闭状态的"分子开关"。通过创新性地运用非经典氨基酸替代技术，研究人员发现破坏该氢键会导致受体自发开放，且该过程贡献了GABA激活能量的35%。这一发现不仅揭示了离子通道门控的新机制，更为靶向该位点的神经药物设计提供了理论依据。

研究主要采用三项关键技术：1) 基于非洲爪蟾卵母细胞的异源表达系统，结合双电极电压钳(TEVC)记录技术；2) 吡咯赖氨酸tRNA介导的非经典氨基酸(ncAA)定点插入，实现主链酰胺-酯键替换；3) 全原子分子动力学(MD)模拟分析不同配体结合状态下氢键距离动态变化。

Main-chain H-bond elimination with ncAAs
通过将β2亚基Ile275替换为α-羟基异亮氨酸(Iah)，特异性消除了主链酰胺氮与Pro273羰基氧的氢键。电生理实验显示，该修饰在野生型受体中诱发7%的自发开放概率，证明该氢键是维持受体关闭状态的关键结构元件。

H-bond in β2 inhibits pore opening
在增益功能突变体(Leu9'Thr)背景下，氢键消除使基础开放概率增加0.6倍，自由能计算显示该氢键抑制通道开放达1.8 kcal/mol。值得注意的是，该效应具有显著亚基特异性——α1亚基的类似氢键修饰完全不影响门控。

H-bond in β2 required to stay closed
野生型受体中，β2(Ile275Iah)突变导致明显的PTX敏感电流，证实该氢键缺失足以破坏受体的静息关闭状态。能量分析表明，两个β2亚基的氢键共同贡献了GABA激活能量的1/3。

H-bond in β2 is state-dependent
分子动力学模拟揭示：在拮抗剂结合(关闭)状态下，β2(Ile275:N-Pro273:O)的供体-受体距离稳定在3?以下；而GABA激活后该距离显著增加至3.5?。这种状态依赖性变化在α1/y2亚基中完全缺失，从结构动力学角度验证了功能实验结论。

这项研究首次在原子尺度阐明：单个主链氢键可以充当离子通道的门控开关。该发现突破了传统认为只有侧链相互作用参与信号转导的认知，为理解蛋白质动态构象变化提供了新范式。从转化医学角度看，β2亚基M2-M3连接区作为全新的药物作用靶点，其主链化学特性不受基因突变影响，可能为开发抗癫痫、抗焦虑药物提供更稳定的干预位点。研究采用的非经典氨基酸技术也为其他膜蛋白的功能研究建立了方法学典范。