工程化改造ATP合酶提升质子-ATP转化效率：突破天然H+/ATP比率的生物能量学创新

本研究针对FoF1-ATP合酶天然H+/ATP比率（2.7-5.0）的局限性，通过创新性设计多外周柄结构，成功构建含3个a亚基的工程化ATP合酶，实现H+/ATP比率5.8的突破。该成果发表于《Nature Communications》，为低质子驱动力条件下的ATP合成提供新策略，开辟了细胞生物能量系统改造的新途径。

　　

在细胞能量代谢的核心地带，F_oF₁-ATP合酶如同精密的分子涡轮机，通过质子流驱动ATP合成。这个由F_o（膜嵌段质子通道）和F₁（催化核心）组成的旋转马达，其能量转换效率直接取决于H⁺/ATP比率——每个ATP分子合成需要转运的质子数。自然界通过调整c亚基环的组成数量（8-15个c亚基）将这个比率控制在2.7-5.0之间，但这种进化策略存在明显局限：更大的c亚基环意味着更笨重的分子机器，且比率提升空间有限。如何在维持分子机器紧凑结构的前提下突破天然比率限制，成为生物能量学领域的重要挑战。

来自日本东京大学等机构的研究团队另辟蹊径，提出颠覆性假设：若增加a亚基数量（而非c亚基），理论上可倍增H⁺/ATP比率。这一构想源于对ATP合酶结构的深入洞察——天然ATP合酶仅含单个a亚基，因其δ亚基的N端结构域破坏了α₃β₃环的三重对称性。研究人员通过基因工程构建δ_ΔN-α融合蛋白（删除δ亚基N端并融合至α亚基），成功突破这一进化限制，创造出含多个外周柄和a亚基的工程化ATP合酶。这项突破性成果发表于《Nature Communications》，为人工设计高效生物能量系统提供了全新范式。

关键技术方法包括：1）构建δ_ΔN-α融合的嗜热芽孢杆菌PS3 F_oF₁-ε_ΔC突变体；2）通过SDS-PAGE定量亚基化学计量比；3）利用蛋白脂质体重建系统测定热力学平衡点确定H⁺/ATP比率；4）冷冻电镜单颗粒分析解析多a亚基复合体结构（分辨率2.5-3.2?）。

【设计多外周柄结构】
通过删除δ亚基N端结构域（残基2-104）并将其C端与α亚基N端融合，研究人员解除了天然ATP合酶的单外周柄限制。SDS-PAGE定量分析显示，工程化F_oF₁中a亚基和b亚基的化学计量比分别达野生型的2.2倍和1.8倍，证实成功构建多外周柄结构。

【功能验证H⁺/ATP比率】
热力学平衡实验表明，δ_ΔN-α融合F_oF₁的H⁺/ATP比率达5.8±0.4，较野生型（3.0±0.2）提升近两倍。在反应商Q=2.5条件下，其平衡质子驱动力（pmf_eq）降至68mV（野生型需133mV），证明工程化酶能在更低pmf条件下驱动ATP合成。

【冷冻电镜结构解析】
冷冻电镜三维重构揭示，工程化F_oF₁可形成含1-3个外周柄的多种构象（占比分别为51%、26%和8%）。其中三外周柄结构显示，c₁₀环可同时容纳三个a亚基，每个a亚基与三个c亚基形成a₁c₃功能单元，且各a亚基结构（Cα-RMSD 0.3-0.5?）与野生型高度相似，证实其功能完整性。

【讨论与意义】
这项研究突破性地证明：1）δ亚基N端是限制外周柄数量的关键因素；2）c环可容纳多个a亚基且功能独立，H⁺/turn数符合N_H⁺/turn=N_c×N_a的新公式；3）工程化策略比天然c环扩增更高效，在嗜酸菌等极端环境微生物中已发现类似基因融合（如Acidaminococcus fermentans）。该成果不仅深化了对ATP合酶工作机制的理解，更为合成生物学改造细胞能量系统开辟新途径——通过调控H⁺/ATP比率，可优化微生物发酵中的NADH/ATP平衡，在光合细菌生物制造等领域具有重要应用前景。