基于径向流微流控芯片与IEDDA化学的肿瘤特异性小细胞外囊泡高通量快速分离技术（ExoOnco ChipEpCAM-TCO）

研究人员针对肿瘤特异性小细胞外囊泡(sEVs)分离中存在的低通量、低纯度及有害释放等问题，开发了集成径向流设计、微柱阵列和IEDDA点击化学的ExoOnco芯片。该技术通过EpCAM抗体靶向捕获非小细胞肺癌(NSCLC)患者血浆中的sEVs，结合DTSSP可逆二硫键实现温和释放，并利用dPCR和WB验证了肿瘤相关标志物(EGFR/EpCAM)的富集效果。这项研究为癌症早期诊断和免疫治疗提供了高效、特异性的sEVs分离平台。

　　

在癌症诊疗领域，小细胞外囊泡(small Extracellular Vesicles, sEVs)因其携带母细胞特征性生物分子而成为"液态活检"的新宠。然而，传统超速离心(UC)、超滤(UF)等方法面临通量低、纯度差、机械损伤等问题，尤其难以捕获血浆中稀少的肿瘤源性sEVs(Tumor Derived sEVs, TDEs)。更棘手的是，现有免疫亲和捕获技术虽能提高特异性，却因抗体结合过强导致sEVs释放困难，严重阻碍下游分析。

为解决这些瓶颈，密歇根大学的研究团队在《Biosensors and Bioelectronics: X》发表了一项突破性研究。他们巧妙改造了曾用于循环肿瘤细胞(CTCs)捕获的OncoBean芯片，开发出集成径向流微柱阵列、逆电子需求狄尔斯-阿尔德(IEDDA)点击化学和DTSSP可逆交联剂的ExoOnco芯片。这种创新设计通过径向流产生的梯度剪切力提升捕获效率，利用生物正交的IEDDA反应实现EpCAM抗体快速偶联，并引入含二硫键的DTSSP实现温和还原释放。

关键技术包括：1）优化微流控芯片表面功能化参数（APTES/DTTSSP孵育时间、流速）；2）Tetrazine(Tz)标记抗体与反式环辛烯(TCO)修饰芯片的IEDDA特异性结合；3）二硫苏糖醇(DTT)还原释放捕获sEVs；4）采用8例NSCLC患者血浆验证临床适用性。

2.1 设备优化与sEV捕获验证
通过调节微柱表面化学修饰参数，确定45分钟APTES和30分钟DTSSP为最佳孵育条件。在1300 μL/min高流速下仍保持高效捕获，PKH67荧光染色和SEM证实sEVs完整附着于微柱间隙。ZetaView分析显示抗体标记未改变sEVs粒径分布（30-200 nm）。

2.2 EpCAM⁺ sEVs的靶向捕获与释放
对比高/低EpCAM表达的H1650/A549细胞系，Tz-EpCAM对H1650 sEVs捕获率达90%，显著高于A549的45%。DTT还原后，WB检测到Flotillin-1、GAPDH等sEV标志蛋白，SEM显示释放后囊泡形态完整。

2.3 NSCLC患者TDEs的临床验证
在8例III期NSCLC患者队列中，Tz-EpCAM捕获的sEVs蛋白量比健康对照组高160%。SEM观察到患者样本特有的"粘性"结构，暗示TDEs可能参与肿瘤微环境形成。WB成功检出EpCAM和EGFR肿瘤标志物，而健康组几乎无信号。

2.4 dPCR分析sEVs核酸标志物
数字PCR显示患者组EpCAM/EGFR基因拷贝数显著高于对照组（p<0.05）。值得注意的是，Tz-EpCAM捕获的sEVs中EpCAM mRNA水平比Tz-CD63组高150%，证实了靶向富集效果。

这项研究通过多学科技术融合，实现了三大突破：首先，径向流设计结合IEDDA化学使处理通量达22 μL/s，远超传统方法；其次，DTSSP介导的还原释放可在10分钟内完成，且保持sEVs生物活性；最重要的是，EpCAM靶向捕获能特异性富集TDEs及其携带的EGFR/EpCAM标志物。尽管存在表面化学残留的潜在限制，该技术为癌症早诊提供了新型sEVs分析平台，未来可通过扩大队列验证其与治疗响应的关联性。这种"捕获-释放-分析"一体化策略，不仅适用于NSCLC，也为其他癌症的液体活检开辟了新途径。