利用大肠杆菌Keio突变体库系统解析Reuterin的抗菌机制及其代谢网络调控

本研究通过大肠杆菌Keio单基因敲除库（Keio collection）高通量筛选，结合GO/KEGG通路分析和蛋白质互作网络（PPI）技术，首次系统揭示广谱抗菌小分子Reuterin通过干扰芳香族氨基酸合成（aroCFK/trpAC）、硫代谢（cysIJ/ydhU）和谷胱甘肽代谢（GSH）通路破坏氧化还原平衡，同时发现生物膜（biofilm）相关基因（omrA/aaeR）缺失通过结构屏障增强耐药性，为新型抗菌剂开发提供关键靶点。

　　

MIC of reuterin for E. coli K-12

Reuterin由Limosilactobacillus reuteri通过甘油一步酶法合成，其溶液浓度为28.81 mmol/L。针对大肠杆菌BW25113的液体培养最小抑菌浓度（MIC）测定为1.15 mM，为后续亚致死浓度筛选奠定基础。

实验可重复性评估

采用Colony-live系统分析3,903个非必需基因缺失突变体在0.5× MIC条件下的生长参数。最大生长速率（MGR）和生长饱和点（SPG）的组内相关系数（ICC）分别达0.826和0.799，显著优于滞后时间（LTG）参数，确认MGR为最可靠评价指标。

候选突变体筛选与功能注释

通过±2σ和P<0.01双标准筛选出159个敏感突变体（如aroC、cysG）和117个耐药突变体（如ackA、gloA）。COG分析显示敏感基因富集于氨基酸转运（E类）和转录调控（K类），而耐药基因集中于辅酶代谢（H类）和碳代谢（G类）。GO分析进一步揭示敏感组在"硫酸盐同化"（FE=10.96）和"芳香族氨基酸生物合成"（FE=6.82）通路显著富集。

KEGG通路网络整合

关键代谢通路交互分析显示：敏感突变体主要影响苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸合成、硫代谢和谷胱甘肽代谢通路。其中aroC缺失导致分支酸合成受阻，cysG缺陷影响硫铁簇组装，共同导致氧化还原失衡。耐药组则通过丙酮酸代谢（tpiA/pgi）和乙酰辅酶A分流（ackA/pta）重构能量代谢，其中gloA缺失激活nemRA-gloA应激操纵子。

蛋白质互作网络核心节点

PPI分析鉴定出敏感组关键蛋白MetQ（甲硫氨酸ABC转运体）和GlyA（一碳代谢酶），耐药组核心蛋白包括HycF（氢化酶3铁硫蛋白）和AckA-Pta（乙酸代谢双组分系统）。特别值得注意的是，ncRNA基因omrA缺失通过上调csgD表达促进生物膜形成，而外膜孔蛋白PhoE缺失可能改变膜通透性。

讨论：抗菌机制的双重策略

Reuterin通过双重机制发挥抗菌作用：
1）代谢脆弱性攻击：靶向芳香族氨基酸和硫代谢关键节点，干扰GSH合成导致ROS累积；
2）结构屏障调控：aaeR缺失增加生物膜屏障，phoE缺失降低膜通透性。耐药突变体则通过代谢流重编程（如TCA循环上调）和甲基乙二醛（methylglyoxal）应激响应实现适应性进化。

材料与方法创新点

研究采用λ RED重组技术构建非编码RNA突变体，结合机器人自动化培养（Singer RoToR HDA）和高通量生长曲线分析（Colony-live2）。生物信息学分析整合STRING数据库互作预测和Cytoscape拓扑算法（Degree/MCC/Closeness），为抗菌机制研究提供多组学范式。

该工作首次系统绘制Reuterin作用靶标网络，不仅阐明其通过代谢干扰和生物膜调控的协同抗菌机制，更为针对代谢脆弱性的新型抗菌剂设计提供理论依据。