基于级联信号放大策略的通用生物传感平台实现HIV超敏检测

为解决HIV早期诊断中传统方法灵敏度不足、操作复杂等问题，研究人员开发了一种整合等温扩增、滚环扩增(RCA)和CRISPR-Cas12a转切割活性的三级级联放大策略。该研究实现了HIV-1 DNA(62 aM)和p24蛋白(8.48 pg/ml)的超敏检测，临床样本验证显示其与RT-PCR结果高度一致，为分子诊断提供了通用型技术框架。

　　

艾滋病病毒(HIV)作为获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的病原体，至今仍是全球重大公共卫生挑战。据世界卫生组织统计，全球已有超过8420万人感染HIV，其中近半数死于艾滋病相关疾病。早期精准诊断对控制疫情至关重要，但现有检测技术如PCR、ELISA等存在灵敏度有限、操作复杂、成本高等瓶颈，尤其在资源匮乏地区难以推广。

针对这一难题，苏州疾病预防控制中心等机构的研究团队在《BMEF (BME Frontiers)》发表研究，提出了一种整合三级信号放大的通用生物传感策略。该技术通过巧妙设计探针系统，将目标识别与级联信号放大模块耦合：首先通过目标诱导的等温扩增产生单链DNA(ssDNA)引物；随后触发滚环扩增(RCA)生成重复序列；最终激活CRISPR-Cas12a系统的反式切割活性，实现荧光信号指数级放大。这种模块化设计使其可同时适配核酸(HIV-1 gag基因)和蛋白(p24抗原)检测。

关键技术包括：(1)双探针介导的等温扩增体系；(2)锁式探针引导的RCA扩增；(3)CRISPR-Cas12a荧光报告系统；(4)临床样本验证采用苏州市疾控中心提供的HIV感染者血液样本，以RT-PCR为金标准对照。

【HIV-1 DNA检测设计】
通过设计P1/P2探针与HIV-1 gag基因形成三向连接结构，经聚合酶延伸和Nb.BbvCI切割循环产生ssDNA引物。电泳证实仅当靶标和酶共存时才能观察到特异性条带，优化显示5个互补碱基的探针组合可平衡特异性和效率。

【HIV-1 DNA检测性能】
在1 fM-10 pM范围内呈现优异线性关系(y=927.680 lgC+6,663.741，R2=0.997)，检测限达62 aM，比电化学发光法灵敏度提高480倍。对HPV、HCV等干扰物表现出高度特异性，临床样本检测结果与RT-PCR完全一致。

【HIV-1 p24检测设计】
将抗体与DNA探针偶联，抗原结合使P1'/P2'探针空间接近触发级联反应。紫外光谱验证抗体-探针偶联成功，rCutSmart缓冲液可最大限度降低背景干扰。

【HIV-1 p24检测性能】
在0.01-1 ng/ml范围内线性良好(y=6,769.500x+4,558.588)，检测限8.48 pg/ml，比传统ELISA灵敏24倍。双盲试验显示与ELISA结果100%吻合，在胎牛血清基质中仍保持稳定性能。

该研究的突破性在于创建了"一体化"检测框架：通过RCA实现¹⁰⁶倍信号放大，结合Cas12a的"分子开关"特性，使灵敏度达到单分子水平。模块化设计允许仅更换探针即可检测不同靶标，显著降低开发成本。临床验证表明其能准确识别早期感染，对实现联合国"2030终结艾滋病"目标具有重要实践意义。

讨论部分特别指出，该技术摆脱了对热循环仪器的依赖，全部试剂可预制冻干，特别适合基层医疗机构使用。未来通过微流控芯片整合，有望开发成便携式检测设备。除HIV外，该策略已开始应用于乙肝、癌症标志物等检测，展现出成为下一代分子诊断通用平台的潜力。