Mayaro病毒与基孔肯雅病毒双重RT-qPCR检测方法的开发与评估：提升新发蚊媒病毒诊断能力

这篇研究开发了一种新型双重RT-qPCR检测方法（MAYVx2-CHIKV），可同时检测Mayaro病毒（MAYV）和基孔肯雅病毒（CHIKV）。该方法通过靶向nsp1基因和5′UTR/nsp1双区域设计，灵敏度达1.7-7.6 RNA拷贝/μL（LOD95），特异性100%，解决了两种临床相似病毒在美洲共流行区的鉴别诊断难题。

　　

ABSTRACT
Mayaro病毒（MAYV）作为蚊媒甲病毒，在亚马逊流域与基孔肯雅病毒（CHIKV）共同流行。由于缺乏商业化检测工具和血清学交叉反应，其真实疾病负担长期被低估。本研究创新性开发了靶向nsp1基因的单重RT-qPCR（MAYV_nsp1），并与已发表的CHIKV检测方法（靶向E1基因）及另一MAYV检测方法（靶向5′UTR/nsp1）整合为双重检测体系（MAYVx2-CHIKV）。该体系采用VIC/FAM双荧光标记，在模拟临床样本中实现<10 RNA拷贝/μL的检测限，线性范围横跨10⁸-10²拷贝/μL，且对12种黄病毒、7种甲病毒等病原体无交叉反应。

INTRODUCTION
MAYV通过 Haemagogus 蚊传播，但伊蚊属可能推动其城市循环。与CHIKV相似的发热、关节痛症状及血清学交叉反应，使得临床鉴别极具挑战性。现有MAYV分子检测工具稀缺，本研究通过MAFFT比对210株MAYV全/部分基因组，筛选出nsp1保守区域设计引物探针，其3′端关键位点与CHIKV等甲病毒存在显著差异。

MATERIALS AND METHODS
实验采用SuperScript III Platinum一步法RT-qPCR体系，对5株CHIKV（覆盖ECSA1-3、西非、亚洲谱系）和1株MAYV（D基因型）进行梯度稀释测试。双重检测中MAYV_nsp1与5′UTR/nsp1探针均标记VIC，CHIKV探针标记FAM。特异性验证涵盖21种虫媒病毒，临床样本包括47例CHIKV阳性血清和32例疟原虫/EBV/CMV感染者血清。

RESULTS

• 灵敏度：MAYV_nsp1单重LOD₉₅为7.6拷贝/μL，双重检测提升至1.7拷贝/μL（MAYV）和1.8-7.0拷贝/μL（CHIKV各谱系）。
• 线性：所有检测R²>0.99，扩增效率>91%，符合MIQE指南要求。
• 临床验证：在CHIKV阳性样本中，双重检测额外检出3例弱阳性（Ct>36）；MAYV模拟样本显示双重体系信号强度优于单重（ΔCt 1.4-3.5）。

DISCUSSION
该研究突破性地将双靶标策略应用于MAYV检测：nsp1靶标提供基因型覆盖广度，5′UTR/nsp1靶标增强突变耐受性。尽管受限于1954年古老毒株的验证，但双重设计显著降低假阴性风险。未来需在流行区开展真实世界验证，并监测新发基因型。该技术将助力MAYV纳入发热病例常规筛查，推动其流行病学与传播机制研究。

技术亮点

• 冻干引物探针（EVAM catalog 001K-06161/2）适合资源有限地区
• 双重检测节省50%样本用量与工时
• 首次实现MAYV与CHIKV Ct值同步解读