睡莲bHLH转录因子家族全基因组分析及NcTT8分子特性研究揭示花色调控新机制

本研究针对水生观赏植物睡莲(Nymphaea colorata)中bHLH转录因子家族的功能特性不明问题，通过全基因组分析鉴定出76个bHLH基因（含5个MYC基因），发现自然选择是密码子使用偏好的主要驱动力。研究重点解析了NcTT8（NcMYC3）的核定位特性与转录激活功能，为阐明bHLH调控花青素合成的分子机制奠定基础，对睡莲分子育种具有重要指导意义。论文发表于《BMC Plant Biology》。

　　

在绚丽多彩的水生植物王国中，睡莲(Nymphaea spp.)以其独特的花色和生态价值占据重要地位。作为基部被子植物的代表，睡莲不仅是园艺观赏的明星物种，更是研究植物进化与适应性机制的理想模型。然而，这个古老植物类群中调控花色形成的关键分子机制——特别是bHLH（basic helix-loop-helix）转录因子家族的功能特性，长期以来如同睡莲叶片下的神秘水域，亟待探索。

bHLH作为植物中最大的转录因子家族之一，在生长发育、次生代谢和逆境响应中发挥核心作用。其中，TT8（TRANSPARENT TESTA 8）作为MBW（MYB-bHLH-WD40）复合体的关键组分，在花青素合成通路中扮演"分子开关"的角色。尽管在拟南芥等模式植物中已有深入研究，但睡莲这类基部被子植物中bHLH家族的进化特征和功能分化仍属未知领域。随着睡莲基因组测序的完成，系统解析其bHLH基因家族成为可能，这对理解早期被子植物花色形成的分子基础具有重要科学价值。

陕西省西安植物园的研究团队在《BMC Plant Biology》发表了突破性研究成果。研究采用全基因组扫描结合生物信息学分析，鉴定出睡莲76个bHLH基因；通过多组学整合分析揭示了该家族的进化规律与功能特性；特别对NcTT8（NcMYC3）进行了分子特性解析。关键技术包括：基于HMMER的基因家族鉴定、MEME蛋白结构域分析、MCScanX共线性分析、Ka/Ks选择压力计算、CodonW密码子偏好性分析、PlantCARE启动子元件预测、烟草瞬时表达系统验证亚细胞定位、酵母双杂交系统检测转录激活活性等。

【Identification and properties of bHLH proteins in N.colorata】
研究首次在睡莲基因组中鉴定出71个bHLH基因和5个MYC基因，分布在13条染色体上（染色体5除外）。这些基因编码的蛋白大小差异显著（181-884个氨基酸），67%呈酸性，全部具有亲水性特征。染色体1基因密度最高（11个），染色体13-14最少（各1个）。

【Protein structure analysis of bHLH proteins in N.colorata】
MEME分析发现Motif1和Motif2在所有bHLH蛋白中保守，而Motif11为MYC蛋白特有。MYC蛋白具有完全一致的基序组成与排列方式，显示高度进化保守性。基因结构分析则显示内含子数量存在显著变异。

【Phylogenetic and evolutionary analysis】
系统发育分析将睡莲bHLH分为17个亚群，XII亚群最大（14成员），IVb最小（1成员）。共线性分析揭示18个基因经历片段重复，5个基因发生串联重复。Ka/Ks分析表明所有复制基因均经历纯化选择（Ka/Ks<1）。密码子使用偏好分析证实自然选择是主要驱动力。

【Cis-acting elements analysis】
启动子分析发现56个bHLH和3个MYC基因含ABA响应元件，58个bHLH和4个MYC基因含MeJA响应元件。47个bHLH和3个MYC基因具有干旱响应元件，39个bHLH和3个MYC基因含低温响应元件，显示广泛的环境调控潜力。

【Expression patterns analysis】
转录组数据显示NcbHLH10和NcbHLH24在多组织中高表达，NcMYC家族成员在幼叶和花中活跃。qRT-PCR验证NcbHLH16、NcbHLH24等在花瓣中特异性高表达，暗示其参与花色调控。

【Functional analysis】
PPI网络分析发现两个核心模块：Cluster1可能参与花器官发育（含BHLH101等），Cluster2与JA信号通路相关（含MYC2等）。GO注释显示多个bHLH与器官发育、胁迫响应相关，如NcbHLH101可能参与低温响应。

【Identification of NcTT8】
通过保守域和系统发育分析，确定NcMYC3为睡莲TT8同源基因。该蛋白含有bHLH-MYC_N和bHLH结构域，与已知TT8蛋白聚为一支。

【Subcellular localization】
烟草瞬时表达显示NcMYC3-GFP融合蛋白特异定位于细胞核，符合转录因子特性。

【Transcriptional activation activity】
酵母系统证实NcMYC3具有转录激活能力，能在SD/-Trp-His培养基生长并使X-α-Gal显色。荧光素酶报告系统显示其LUC/REN比值显著高于阴性对照。

这项研究首次系统解析了睡莲bHLH基因家族的进化特征与功能特性，填补了基部被子植物相关研究的空白。研究发现自然选择是塑造睡莲bHLH密码子使用偏好的主要力量，而基因复制事件（特别是片段重复）推动了该家族的扩张。重要的是，研究鉴定出NcMYC3为睡莲TT8同源基因，其核定位特性与转录激活能力的证实，为后续解析MBW复合体调控花青素合成的分子机制奠定了基础。

从应用角度看，该研究为睡莲分子育种提供了关键靶点。通过调控NcTT8及其互作网络，有望定向改良睡莲花色性状，提升观赏价值。从理论意义而言，研究揭示了早期被子植物bHLH家族的进化规律，为理解转录因子家族的功能分化提供了新视角。特别值得注意的是，睡莲bHLH在JA信号通路和逆境响应中的潜在作用，为研究水生植物环境适应机制开辟了新途径。

未来研究可进一步解析NcTT8与MYB、WD40蛋白的互作网络，通过遗传转化验证其在花青素合成中的调控功能。此外，比较不同花色睡莲品种中bHLH的表达模式，将有助于发掘关键调控节点。该研究建立的睡莲bHLH家族数据库，将为相关研究提供重要资源。