辣椒炭疽病菌Colletotrichum scovillei不同生长阶段及宿主互作中稳定内参基因的筛选与验证

本研究针对辣椒炭疽病病原菌Colletotrichum scovillei缺乏稳定内参基因的问题，通过转录组分析筛选出8个候选基因（CsUCE、CsCK等），利用qRT-PCR技术结合geNorm、NormFinder和BestKeeper算法，首次系统评估了其在孢子萌发、菌丝生长、宿主互作及植物提取物处理等条件下的表达稳定性。研究发现CsPP2A在生长阶段、CsTUB在宿主互作、CsUCE在植物提取物处理时表现最优稳定性，为病原菌致病机理研究和抗真菌药物开发提供了关键标准化工具。

　　

辣椒炭疽病是威胁全球辣椒生产的重要病害，其中Colletotrichum scovillei作为C. acutatum复合种的核心成员，可造成高达40%的产量损失。尽管分子生物学技术已广泛应用于病原菌研究，但精确量化基因表达的关键前提——稳定内参基因的缺失，严重制约着该病原菌致病机理的解析。尤其当研究涉及不同发育阶段（如孢子、菌丝）、宿主互作或新型植物源杀菌剂处理时，传统内参基因如ACT或GAPDH可能因表达波动导致数据失真。这一瓶颈问题使得开发环境友好型防控策略缺乏可靠的分子评价体系。

针对这一挑战，韩国忠南大学应用生物学系Sang-Keun Oh团队联合国际生物材料研究中心，在《BMC Plant Biology》发表了突破性研究。研究人员基于C. scovillei转录组数据，从NCBI基因组中筛选出8个候选内参基因（CsUCE、CsCK、CsTBP、CsTIF、CsPP2A、CsTUB、CsCAL和CsNADH），通过qRT-PCR技术结合三种算法（geNorm/NormFinder/BestKeeper），系统评估了这些基因在三种实验体系中的稳定性：生长阶段（孢子、萌发孢子、菌丝）、宿主（辣椒）互作、以及0.5% DMSO和抗真菌植物提取物（Cestrum glanduliferum，EC₅₀=5 ppm）处理。关键技术包括：基于转录组数据的候选基因筛选、引物特异性验证（熔解曲线+电泳）、标准曲线法计算扩增效率（90-110%）、三算法稳定性评估体系，以及用CsRAC1（Rho GTP酶家族基因）和CsERG2（甾醇合成通路基因）进行验证实验。

生长阶段稳定性分析
通过geNorm算法发现，蛋白磷酸酶PP2A调控亚基（CsPP2A）在孢子发育过程中稳定性最高（M=0.0126），其表达水平在孢子萌发和菌丝生长阶段变异系数（CV）仅2.8%。这一结果被NormFinder进一步验证（稳定性值0.025），显著优于传统内参基因如微管蛋白（CsTUB，CV=4.8%）。

宿主互作体系验证
在辣椒感染实验中，β-微管蛋白（CsTUB）展现出卓越的稳定性（geNorm M=0.0343），其Ct值标准差（SD=0.367）远低于其他候选基因。这与先前在C. gloeosporioides中的研究结论高度一致，提示TUB基因在Colletotrichum-植物互作研究中具有普适性。

植物提取物处理模型
面对新型生物农药开发需求，研究发现泛素结合酶（CsUCE）在0.5% DMSO和C. glanduliferum提取物处理时稳定性最佳（NormFinder值0.0205）。当用该基因标准化时，甾醇异构酶ERG2的表达下调趋势更显著（p<0.01），准确反映了植物提取物干扰真菌膜结构的分子机制。

这项研究首次建立了C. scovillei多场景下的内参基因使用标准：生长阶段推荐CsPP2A+CsCAL组合，宿主互作首选CsTUB，植物提取物处理采用CsUCE。该成果不仅解决了病原菌基因表达研究的标准化难题，更为重要的是，为开发基于植物提取物的绿色杀菌剂提供了精准的分子评价工具。例如，通过CsUCE标准化发现的ERG2下调效应，直接证实了C. glanduliferum提取物通过破坏真菌细胞膜发挥药效的假说。这些发现将显著加速辣椒炭疽病防控策略的研发进程。