长春花(Catharanthus roseus)中SPL转录因子家族与miR156a/SPLs模块调控萜类吲哚生物碱合成的全基因组分析

本研究针对抗癌药物长春花碱等萜类吲哚生物碱(TIAs)含量低下的产业瓶颈，首次系统解析了长春花中14个SPL转录因子(CrSPLs)的基因组特征及其与Cro-miR156a的互作机制。通过酵母单杂交(Y1H)和双荧光素酶(Dual-Luc)等实验证实CrSPLs能直接激活长春花碱合成通路关键酶基因启动子，而Cro-miR156a通过抑制CrSPLs负调控TIAs积累。该研究为通过基因编辑靶向调控TIAs合成提供了新靶点，发表于《BMC Plant Biology》。

　　

长春花(Catharanthus roseus)作为"植物药房"，其合成的长春花碱(vinblastine)和长春新碱(vincristine)是临床常用的抗癌药物。然而这些高价值萜类吲哚生物碱(Terpenoid Indole Alkaloids, TIAs)在植物体内含量极低，仅占干重的0.0001%-0.01%，难以满足临床需求。传统提取方法成本高昂，而化学合成又因分子结构复杂难以实现。虽然已有研究揭示了AP2/ERF、MYC等转录因子(TFs)对TIAs合成的调控作用，但SPL(SQUAMOSA Promoter Binding Protein-Like)家族这一植物特有的转录因子在长春花中的功能仍属空白。

为解决这一科学问题，上海交通大学农业与生物学院的研究团队开展了系统性研究。通过全基因组分析鉴定出14个CrSPL基因，结合分子生物学和生物化学手段，首次揭示了Cro-miR156a/CrSPLs模块对TIAs合成的调控网络。研究发现CrSPLs能直接结合长春花碱合成通路中strictosidine β-D-glucosidase(CrSGD)、loganic acid O-methyltransferase(CrLAMT)等关键酶基因启动子的"GTAC"核心 motif，而Cro-miR156a通过转录后抑制CrSPLs表达间接调控TIAs积累。该成果为通过基因工程精准调控TIAs合成提供了新策略，对实现抗癌药物的可持续生产具有重要意义。

研究主要采用以下关键技术：1) 基于HMMER的基因组挖掘与生物信息学分析；2) 酵母单杂交(Y1H)验证蛋白-DNA互作；3) 双荧光素酶报告系统(Dual-Luc)检测启动子活性；4) 甲基茉莉酸(MeJA)诱导实验；5) 长春花子叶瞬时转化系统验证基因功能。实验材料采用商业品种'SunStorm Red'长春花和本氏烟(Nicotiana benthamiana)。

基因组鉴定与进化分析
在全基因组水平鉴定出14个CrSPL基因，根据系统发育分为8个亚群。基因复制分析发现CrSPL7-CrSPL8和CrSPL2-CrSPL9两对复制基因，与拟南芥的共线性分析显示SPL家族在进化上高度保守。启动子顺式元件分析发现53.8%的元件与胁迫响应相关，31.1%为JA响应元件MYC，暗示CrSPLs可能参与应激和激素调控。

组织特异性与激素响应
RT-qPCR显示CrSPL1/2/3/7/8/10在成熟叶中高表达，CrSPL5/6/11/12/13/14在花中优势表达。MeJA处理显著上调CrSPL2/5-10/12表达，而抑制CrSPL1/3/11/13，表明不同成员在JA信号通路中功能分化。

miR156a/SPLs调控模块
psRNATarget预测显示Cro-miR156a-d靶向CrSPL2/3/4/5/9/12。双荧光素酶实验证实Cro-miR156a可使CrSPL2-5的荧光活性降低38%-69%。长春花子叶瞬时过表达Cro-miR156a使靶基因CrSPL2/3/5表达量下降21%-69.7%，并显著抑制CrG10H、CrLAMT等9个TIAs通路基因表达。

CrSPLs对TIAs合成的直接调控
酵母单杂交验证CrSPL8/12结合CrSGD启动子第二个"GTAC"盒，CrSPL2/3/4/5/8/9结合CrLAMT第三个"GTAC"盒。双荧光素酶显示CrSPL2/3/4/5/9/12能激活CrSGD和CrGS启动子活性2-5倍，而CrSPL9特异性激活Cr7DLGT和CrLAMT。

该研究首次阐明SPL转录因子家族通过"GTAC"顺式元件直接调控TIAs生物合成通路，并揭示Cro-miR156a通过抑制CrSPLs负向调节这一过程。特别值得注意的是，CrSPLs对下游基因的调控具有显著特异性——如CrSPL9能特异性激活甲基转移酶CrLAMT，而CrSPL3/8则偏好结合还原酶CrT3R启动子。这种精细调控模式为未来设计"定制化"代谢工程提供了可能。研究还发现JA信号通过差异调控CrSPLs成员表达影响TIAs积累，这为开发基于外源激素诱导的生产工艺提供了理论依据。

从应用角度看，该成果突破了传统TIAs生产依赖野生植株提取的局限：一方面可通过基因编辑削弱Cro-miR156a对CrSPLs的抑制，另一方面可靶向过表达特定CrSPLs成员（如能同时激活多个关键酶的CrSPL2/5）来协同提升代谢流。这种"双轨调控"策略比单一酶基因过表达更具优势，有望使TIAs产量实现数量级提升。随着合成生物学技术的发展，该调控模块可进一步与细胞工厂技术结合，为抗癌药物的绿色制造开辟新途径。