新型着丝粒质粒助力Aurantiochytrium limacinum实现稳定染色体外基因表达

本研究针对海洋破囊壶菌Aurantiochytrium limacinum（BL10）基因工具不足的瓶颈，开发了首个基于Phaeodactylum tricornutum染色体24来源的500 bp着丝粒样序列（PIT24）的穿梭质粒。该质粒在无抗生素选择压力下仍能保持96.8±0.3%的分离效率，显著提升了DHA生产菌株的基因操作灵活性，为可持续水产饲料开发提供新工具。

　　

随着全球水产养殖产量在2022年首次超越野生捕捞，其可持续发展却面临关键矛盾——饲料仍依赖海洋资源。虽然植物蛋白等已成功替代鱼粉，但富含omega-3脂肪酸的鱼油替代品开发却举步维艰。当前微生物来源的DHA（二十二碳六烯酸）存在脂肪酸谱不平衡（高DHA低EPA）和成本过高等问题。Aurantiochytrium limacinum（曾用名Schizochytrium）作为极具潜力的单细胞油脂生产者，其遗传改造却受限于低效的染色体整合技术，存在插入突变等风险。

为突破这一技术壁垒，国立成功大学等机构的研究团队在《Applied Microbiology and Biotechnology》发表研究，首次在A. limacinum中构建了具有自主复制能力的着丝粒质粒。该研究通过电穿孔将含P. tricornutum染色体24低GC含量区段的穿梭载体导入BL10菌株，发现500 bp的PIT24序列能使质粒以闭合环状DNA形式稳定存在，无需整合至宿主基因组即可实现高效遗传操作。

关键技术包括：1）基于GC含量预测P. tricornutum着丝粒样序列；2）构建含不同维持序列（CA/PIT24-30）的穿梭载体；3）通过电穿孔转化BL10的类变形细胞；4）采用实时PCR和拯救实验验证质粒稳定性；5）四轮传代培养评估分离效率。

材料与方法创新
研究团队设计了包含18S rDNA同源臂、内源启动子（eflα/泛素）和终止子（gapdh）的系列载体。当引入酵母源CEN6-ARSH4（CA）序列时，转化效率从线性载体的<0.02提升至0.05±0.01。通过载体小型化（缩短启动子/终止子）进一步将效率提升至0.46±0.20，但仅含CA序列的载体无法在宿主中稳定维持。

核心发现

1. PIT24的卓越性能：替换为P. tricornutum染色体24的500 bp低GC序列后，所有转化子均检测到完整质粒，显著优于CA序列（仅25%检出率）和其他染色体（29/30）来源序列。
2. 稳定遗传特性：在无G418选择的四轮培养（约23代）后，pUNG2-PIT24仍保持96.8±0.3%的分离效率，证实其能像天然染色体般精确分配至子代细胞。
3. 技术兼容性：该体系支持大肠杆菌-破囊壶菌穿梭操作，通过简单撤除抗性压力即可消除外源DNA，规避了转基因生物（GMO）监管难题。

讨论与展望
该研究首次证实异源着丝粒序列在破囊壶菌中的功能保守性，其创新性体现在：1）建立非整合型基因表达平台，避免插入突变；2）为迭代代谢工程（如EPA引入）提供"长期瞬时表达"工具；3）相较于已报道的pSH65质粒，PIT24展现出更稳定的遗传特性。未来可进一步优化载体骨架，或将此策略拓展至其他经济微藻。这项突破不仅推动A. limacinum的基础研究，更为微生物DHA的工业化生产铺平道路。