优化Langendorff游离法分离成年小鼠房室结细胞及其电生理特性研究

本研究针对房室结(AVN)细胞分离技术难题，开发了一种优化的非Langendorff灌注法，通过靶向酶解结合改良灌注策略，成功获得高活性AVN细胞。研究人员采用免疫荧光染色验证HCN4阳性细胞，通过膜片钳技术记录动作电位(AP)和离子电流(If、ICa-L、INa)，并利用IonOptix系统检测钙瞬变。该方法为房室传导障碍的机制研究和治疗策略开发提供了重要技术平台。

　　

心脏作为精密的生物电器官，其节律调控依赖于特殊的传导系统。房室结(AVN)作为连接心房与心室的关键"中继站"，不仅负责传导窦房结(SAN)的电信号，还具备次级起搏功能。然而，由于AVN区域细胞网络致密、解剖位置特殊，传统Langendorff灌注法存在酶解不充分、细胞存活率低等问题，严重制约了对其电生理特性的深入研究。

针对这一技术瓶颈，华中科技大学同济医学院附属协和医院心血管研究所团队在《BMC Cardiovascular Disorders》发表研究，开发了一种创新的非Langendorff灌注技术。该方法通过主动脉插管联合纱布填塞的改良设计，实现了AVN区域的均匀酶解，成功分离出具有完整电生理特性的成年小鼠AVN细胞。

关键技术包括：(1)改良灌注系统：通过主动脉插管联合纱布填塞优化酶解液分布；(2)多参数验证：采用HCN4免疫荧光标记鉴定AVN细胞；(3)功能检测：运用膜片钳技术记录自发动作电位及I_f、I_Ca-L等离子电流；(4)动态监测：通过IonOptix系统同步检测钙瞬变和肌节收缩。研究使用6-8周龄C57BL/6雄性小鼠作为模型。

主要研究结果：

1. 细胞分离与鉴定
   改良方法使每颗心脏平均获得10个AVN细胞，免疫荧光显示HCN4(超极化激活环核苷酸门控通道4)表达显著高于心室肌细胞，Western blot进一步验证该标志物表达差异。

2. 形态学特征
   AVN细胞呈纺锤形，体积小于心房肌细胞，在含钙台氏液中表现出自发节律性，这与矩形的心室肌细胞形成鲜明对比。

3. 电生理特性
   膜片钳记录显示自发动作电位符合典型AVN特征，包括最大舒张电位(-65.3±2.1 mV)和舒张期去极化速率(58.4±6.2 mV/s)。I_f电流呈现特征性电压依赖性激活，峰值电流密度达-3.5 pA/pF。

4. 离子通道功能
   L型钙电流(I_Ca-L)和T型钙电流(I_Ca-T)峰值分别为-8 pA/pF和-3.5 pA/pF，钠电流(I_Na)密度达-40 pA/pF，与文献报道的啮齿类AVN电流特征一致。

5. 钙调控机制
   钙瞬变检测显示振幅为0.13±0.013 (F₃₄₀/F₃₈₀)，肌节收缩幅度0.232±0.033 μm，证实分离细胞保持完整的兴奋-收缩耦联功能。

研究意义与展望：
该研究建立的AVN细胞分离技术突破了传统方法的局限性，为深入解析房室传导的分子机制提供了可靠工具。特别值得注意的是，该方法保留的I_f电流和钙时钟功能，为研究"膜电压时钟"与"Ca²⁺时钟"的协同作用创造了条件。作者在讨论中指出，未来结合单细胞RNA测序等新技术，可进一步揭示AVN细胞的异质性。这些发现不仅为心律失常机制研究提供新视角，也为开发靶向AVN的调控策略（如房颤心室率控制）奠定了实验基础。

技术层面，研究团队特别强调了纱布填塞对改善AVN区域灌注的关键作用，这一创新设计解决了传统方法中酶解液重力性分布不均的问题。尽管操作复杂度有所增加，但获得的细胞质量和数量显著提升，使得后续的高通量药物筛选和基因编辑研究成为可能。这项技术突破将推动心脏传导系统研究进入更精细的细胞分子水平。