时空动态塑造肝细胞异质性：新生儿克隆源性肝细胞对体内基因工程的影响及机制研究

本研究通过克隆追踪、单细胞和空间转录组学技术，揭示了新生儿肝脏中15-20%的克隆源性肝细胞主导成年肝脏生成，其与造血岛共定位形成增殖生态位。研究发现肝细胞异质性影响慢病毒载体（LV）基因递送效率及小叶分布，而蛋白酶体活性上调是成年肝细胞低转导率的关键因素。该成果为优化肝靶向基因治疗策略提供了理论依据。

　　

肝脏作为人体代谢中枢，其细胞动态与功能分区（zonation）一直是生命科学领域的核心议题。尽管成人肝细胞代谢异质性已被广泛研究，但新生儿肝脏如何通过少数增殖细胞构建成熟器官的机制仍是未解之谜。这一认知缺口直接制约了肝靶向基因治疗的发展——尤其是针对需终身治疗的儿科遗传代谢疾病，如血友病和α₁-抗胰蛋白酶缺乏症。现有腺相关病毒（AAV）载体因无法整合基因组，在细胞增殖中易丢失疗效，而慢病毒载体（LV）和CRISPR/Cas9基因编辑虽能实现稳定修饰，但其效率与持久性受肝细胞增殖动态的深层影响。

为破解这一难题，研究人员通过多组学联用策略，系统描绘了小鼠出生后肝脏生长的时空图谱。研究首先利用Alb.CreERT2/R26-Confetti遗传示踪系统，结合5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）标记，量化了不同发育阶段肝细胞增殖动力学。通过建立数学模型，模拟了克隆扩增对基因修饰区域占比的动态影响。单核RNA测序（snRNA-Seq）和MERFISH空间转录组技术揭示了肝细胞亚群的转录特征及其空间定位，而离体功能实验验证了生态位信号分子的调控作用。基因治疗评估采用VSV.G假型LV和AAV-CRISPR系统，通过免疫荧光、流式细胞术和血浆因子IX（hFIX）检测量化治疗效果。

大多数成年肝组织源自新生儿期的克隆源性肝细胞亚群
遗传示踪显示，新生儿期约25%的肝细胞形成持续扩增的克隆簇，最终贡献90%的成年肝脏。数学建模证实，15-20%的增殖肝细胞驱动器官生长，其增殖速率随年龄呈指数下降。EdU标记实验进一步验证新生儿肝细胞增殖率（15-20%）显著高于成年期（<1%）。

单核转录组分析揭示增殖性肝细胞的未成熟特征
snRNA-Seq鉴定出7个肝细胞亚群，其中高表达Mki67的簇4-5富集细胞周期通路，但下调白蛋白（Alb）等成熟功能基因。值得注意的是，这些增殖细胞显著上调血红素代谢通路，暗示其与造血生态位的功能关联。

基因修饰初始分布决定终末器官工程化比例
同源定向修复（HDR）介导的基因编辑在增殖肝细胞中效率提高3倍（45% vs 15%），导致成年期基因修饰区域扩大2倍。相反，LV转导均匀分布于增殖与非增殖细胞，维持稳定的标记比例。数学模型精准预测了不同策略下修饰区域的动态变化。

LV给药年龄影响转导效率与小叶分布
新生儿和幼鼠（2周龄）肝细胞LV转导效率是成年的4倍，这种差异与蛋白酶体通路活性呈负相关。空间分析显示，年轻个体中转导偏向中央静脉周围（PC区），而成年后转为门静脉周围（PP区）优势分布。蛋白酶体抑制剂Bortezomib处理使成年肝转导效率恢复至新生儿水平。

克隆源性肝细胞与造血祖细胞共定位于新生肝生态位
MERFISH空间转录组发现增殖肝细胞（簇5）与造血干细胞/祖细胞（HSPC）形成解剖学邻近。Nichenet分析鉴定出BMP2、IGF1/2等6种生态位信号分子，离体实验证实其可诱导新生肝细胞重现簇5转录特征。

这项研究首次系统阐明了肝细胞增殖异质性对基因治疗的深层影响。发现克隆源性肝细胞的生态位调控机制，为靶向递送提供了新思路；揭示蛋白酶体活性是LV转导的年龄依赖性屏障，提出临床可操作的增效策略（如Bortezomib预处理）。更重要的是，证明HDR编辑可天然富集于增殖细胞，为儿科遗传病的"一次治疗、终身获益"目标提供了理论框架。空间多组学技术的创新应用，不仅绘制了肝发育的分子图谱，更为复杂器官的动态研究树立了新范式。未来通过解析生态位信号网络，或可人工诱导肝细胞增殖潜能，推动再生医学发展。