酵母多重代谢工程实现高效全反式维甲酸生物合成：从β-胡萝卜素底盘构建到1.84 g/L发酵突破

本研究针对全反式维甲酸(ATRA)生物合成效率低下的问题，通过构建β-胡萝卜素高产酵母底盘、优化ATRA模块基因组合、调控内质网(ER)尺寸、平衡NADPH/NAD+比例等系统代谢工程策略，最终在5-L生物反应器中实现1.84 g/L ATRA产量，创下微生物合成新纪录，为维生素A衍生物的工业化生产奠定基础。

　　

全反式维甲酸(ATRA)作为维生素A的活性衍生物，在细胞分化、免疫调节和皮肤疾病治疗中具有重要作用。然而传统化学合成法存在工艺复杂、环境污染等问题，而微生物合成又面临产量低、转化效率不高等瓶颈。目前报道的最高ATRA产量仅为545.28 mg/L，远不能满足市场需求。更关键的是，现有研究对ATRA合成途径的亚细胞定位、辅因子平衡等关键科学问题缺乏系统认识，制约着工业化进程的推进。

中国科学院天津工业生物技术研究所的研究团队在《Microbial Cell Factories》发表研究，通过多重代谢工程策略改造酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，实现了ATRA的高效生物合成。研究首先构建高产β-胡萝卜素的酵母底盘，随后系统优化ATRA合成模块，并创新性地通过调控细胞器功能、辅因子供应等策略提升合成效率，最终在5-L生物反应器中获得1.84 g/L的ATRA产量，较此前最高水平提高3.4倍。

研究采用CRISPR-Cas9基因编辑、荧光共定位、转录因子调控等关键技术。通过比较不同来源的β-胡萝卜素合成酶基因组合，筛选出Xanthophyllomyces dendrorhous来源的XdCrtYB/XdCrtI最优组合；利用GFP/RFP标记确定关键酶blh的内质网定位；过表达INO2转录因子扩大内质网体积；引入大肠杆菌(Escherichia coli)的sthA基因平衡NADPH/NAD⁺比例；通过Vitreoscilla血红蛋白(VHb)提升氧供应；采用m⁶A甲基转移酶IME4增强乙酰辅酶A供应。

Construction of β-carotene-producing strains

研究团队首先比较了不同来源的β-胡萝卜素合成酶组合，发现X. dendrorhous来源的XdCrtYB/XdCrtI在酿酒酵母中表现最优，与先前在Yarrowia lipolytica中的研究结论相反。通过更换BY-HMG*3底盘平台并增加基因拷贝数，最终构建的Car09菌株β-胡萝卜素产量达129.4 mg/L，较初始菌株提高5倍。

Screening efficient genetic elements for ATRA production

在ATRA合成模块筛选中，发现来自海洋细菌MED66A03的blh与小鼠RALDH2组合效果最佳。引入该模块的RA05菌株在双相培养系统中可产生98.1 mg/L ATRA，同时积累154.9 mg/L β-胡萝卜素，表明代谢流分配仍需优化。

Effects of ER expansion on ATRA production

荧光共定位证实blh定位于内质网(ER)，而RALDH2位于细胞质。通过过表达调控ER大小的转录因子INO2，使RA06菌株的ATRA产量提升34%，总类维生素A产量增加67%，证实ER扩容可显著促进膜结合酶的功能。

Balancing redox cofactor supply

引入大肠杆菌的转氢酶sthA后，RA07菌株的β-胡萝卜素产量翻倍，但ATRA产量略有下降。这表明sthA介导的NADPH再生更有利于上游代谢流，提示需要更精确的辅因子调控策略。

Enhancing the oxygen supply by expressing Vitreoscilla hemoglobin

由于blh催化的β-胡萝卜素裂解需要氧气参与，表达VHb使RA08菌株的ATRA产量提高49.2%，证实氧供应是限制ATRA合成的关键因素之一。

Enhancing terpene production through IME4 expression

通过m⁶A甲基化修饰调控乙酰辅酶A代谢，RA09菌株的总维生素A产量提升17.8%，显示表观遗传调控在代谢工程中的应用潜力。

Fed-batch fermentation for production of ATRA

在5-L生物反应器中，经过营养缺陷标记回复的RA12菌株采用两阶段发酵策略，最终ATRA产量达1.84 g/L，创下微生物合成新纪录。但发酵液中仍残留3.40 g/L β-胡萝卜素，表明ATRA合成模块仍有优化空间。

该研究通过系统代谢工程策略，首次在酿酒酵母中实现克级ATRA生产。创新点包括：揭示blh的ER定位特征并建立ER扩容策略；发现ATRA对blh的反馈抑制现象；开发多模块协同优化方案。这些发现不仅为ATRA工业化生产奠定基础，也为其他疏水性天然产物的微生物合成提供新思路。值得注意的是，研究过程中发现的代谢流分配不均、辅因子需求冲突等问题，为后续研究指明了方向，如开发动态调控系统、工程化细胞器互作等。该成果标志着我国在维生素衍生物合成生物学领域取得重要突破。