酿酒酵母Haa1p和Hap4p转录因子在混合糖发酵中协同调控乙酸和甲酸耐受性的分子机制

本研究针对木质纤维素水解液中乙酸和甲酸抑制剂共存导致酿酒酵母发酵性能下降的难题，通过过表达转录因子HAA1和HAP4构建工程菌株，结合转录组分析揭示了二者在混合糖发酵过程中调控弱酸耐受性的分子机制。研究发现Haa1p通过激活乙醛酸循环和核苷酸代谢、抑制坏死性凋亡等途径增强耐受性，而Hap4p则通过调控转运蛋白表达和孢子形成等机制发挥作用，为构建高效木质纤维素乙醇生产菌株提供了新靶点。

　　

在生物燃料领域，木质纤维素作为廉价丰富的原料备受关注，但其水解液中存在的抑制剂严重制约发酵效率。其中，乙酸和甲酸作为最主要的弱酸抑制剂，会协同抑制酿酒酵母的生长和发酵性能，特别是在木糖利用阶段更为敏感。虽然已有研究揭示了单个转录因子对特定抑制剂的响应机制，但在混合糖（葡萄糖和木糖）发酵条件下，细胞如何应对多种弱酸协同胁迫仍知之甚少。四川大学的研究团队在《Microbial Cell Factories》发表的研究，通过系统解析转录因子Haa1p和Hap4p的调控网络，为这一难题提供了新的解决方案。

研究采用RNA-seq转录组测序、RT-qPCR验证和生物信息学分析等技术方法，以能利用木糖的絮凝型酿酒酵母工程菌株s6H3（HAA1过表达）和s6P5（HAP4过表达）为研究对象，在含2.4 g/L乙酸和0.46 g/L甲酸的混合糖培养基中进行批量发酵实验。通过比较转录组分析揭示关键调控通路，并利用YEASTRACT数据库和STRING蛋白互作网络预测转录因子调控关系。

研究结果部分：
背景与发酵性能
研究发现HAA1或HAP4过表达均能显著提高菌株在混合弱酸胁迫下的木糖消耗速率，其中s6H3在抑制剂存在时的木糖消耗速率比原始菌株s6提高87.14%，证实这两个转录因子在增强抑制剂耐受性中的重要作用。

转录组分析
通过比较C_H vs. C_S（无抑制剂）和AF_H vs. AF_S（含抑制剂）组的差异表达基因（DEGs），发现HAA1过表达在弱酸胁迫下引起更显著的转录组响应，差异基因数量增加290.60%。KEGG富集分析显示，糖酵解和磷酸戊糖途径（PPP）相关基因显著下调，而乙醛酸循环和核苷酸代谢基因上调。

转录因子调控网络
Haa1p直接调控12.69%的DEGs，并通过中间转录因子（如Gcr1p、Rtg3p）间接调控52.74%的基因。在弱酸胁迫下，Haa1p与Tye7p等转录因子形成更复杂的调控网络。

Haa1p调控机制
在混合弱酸胁迫下，Haa1p通过上调CIT2和ICL1等乙醛酸循环基因促进乙酸利用，同时激活核苷酸代谢和RNA聚合酶活性相关基因，并抑制坏死性凋亡和核糖体生物合成相关基因表达。

Hap4p调控机制
Hap4p则表现出不同的调控模式，上调LEU1（亮氨酸合成）、ALD6（乙醛代谢）和NCE103（碳酸酐酶）等基因维持pH稳态，同时激活PDR5（ABC转运蛋白）和STL1（甘油转运蛋白）等外排系统，并促进RPL8A等核糖体基因表达和孢子形成相关基因SLZ1的表达。

这项研究首次系统阐明了Haa1p和Hap4p在酿酒酵母应对混合弱酸胁迫中的协同但差异化的调控机制。Haa1p主要通过代谢重编程（激活非发酵碳源利用和核苷酸合成）和抑制细胞死亡途径增强耐受性，而Hap4p则侧重维持细胞稳态（pH平衡和毒性物质外排）和压力适应结构（核糖体和孢子）的合成。这些发现不仅深化了对酵母胁迫响应的理解，更重要的是为定向改造工业菌株提供了多个可操作的分子靶点，如乙醛酸循环关键酶、核苷酸合成通路和ABC转运蛋白等，对推动木质纤维素乙醇的工业化生产具有重要指导意义。