基于FPS-POS/NEG策略的二维质谱分析程序精准区分花青素与其他黄酮类化合物的研究

推荐：本研究针对传统串联质谱(MS)分析难以区分花青素(anthocyanins)与共存黄酮类化合物(flavonoids)的难题，开发了基于快速极性切换(FPS)的MS1正负离子强度比(FPS-POS/NEG)策略及自动化程序FPS_P/N。该技术通过质子化/去质子化吉布斯自由能差异和源内裂解(ISF)机制，实现花青素(5.98-9.28)与其他黄酮类(-2.52-2.08)前体离子的精准判定，在蓝莓样本中成功注释20种花青素和14种黄酮类化合物，为复杂基质中活性成分高通量鉴定提供新方法。

　　

在植物王国中，花青素(anthocyanins)因其绚丽的色彩和卓越的抗氧化能力备受关注。这类独特的黄酮类化合物(flavonoids)不仅赋予蓝莓、紫葡萄等果蔬迷人的色泽，更通过清除自由基、减轻氧化应激展现出防治癌症、心血管疾病等潜力。然而，花青素在自然界中常与其他黄酮类化合物共存，两者共享C6?C3?C6骨架和相似的生物合成途径，加之糖基化、酰基化等修饰带来的结构复杂性，使得传统质谱(MS)分析面临严重干扰——例如氰定-3-葡萄糖苷(Cya 3-O-glu)与山柰酚-3-葡萄糖苷(kaempferol 3-O-glycoside)在正离子模式下具有完全相同的MS¹(C₂₁H₂₁O₁₁⁺)和MS²(m/z 287)特征，导致假阳性注释率居高不下。

针对这一技术瓶颈，澳门科技大学的研究团队在《Journal of Pharmaceutical Analysis》发表创新成果，开发了基于快速极性切换(FPS)的二维质谱分析程序FPS_P/N。该技术通过整合分子网络(MN)筛选、FPS-POS/NEG前体离子判定和MS²注释三大模块，首次实现单次进样同步捕获正负离子信号，并发现花青素(5.98-9.28)与其他黄酮类(-2.52-2.08)存在显著差异的强度比特征。通过密度泛函理论(DFT)计算揭示，这种差异源于花青素阳离子特性导致的质子化(ΔG≈0 kcal/mol)与双质子去质子化(ΔG=13.54 kcal/mol)能量悬殊，而普通黄酮类的单质子转移能量差仅0.69 kcal/mol。实验验证显示，在0.1%-2%甲酸(FA)的宽pH范围内，该方法保持0.011分钟保留时间偏差和0.38%-4.62%的相对标准偏差(RSD)，对酰化/非酰化花青素均适用。

关键技术方法包括：1) 采用UHPLC-Q-TOF/MS系统结合FPS模式同步采集正负离子MS¹数据；2) 基于B3LYP/DEF2-SVP理论水平计算质子化/去质子化吉布斯自由能；3) 构建自动化分析流程整合MN聚类、m/z候选池筛选及FPS-POS/NEG比值计算；4) 使用市售蓝莓样本验证方法实用性。

研究结果部分：
3.1.1节通过12种标准品对比，首次量化花青素与其他黄酮类的FPS-POS/NEG差异，发现该比值随花青素B环氧化程度降低而升高(Pel 3-O-glu 9.28 > Cya 3-O-glu 7.65 > Del 3-O-glu 5.98)，而黄酮类则呈现C-糖苷(1.91-2.08) > 7-O-糖苷(1.58-1.59) > 3-O-糖苷(-2.52--1.29)的规律。
3.1.2节通过理论计算阐明机制，花青素的ΔΔG(13.54 kcal/mol)显著高于黄酮类(0.69 kcal/mol)，且3-O-糖苷黄酮的源内裂解(ISF)损失达47%-70%，远高于花青素(17%-19%)。
3.3节在蓝莓样本中验证发现，该方法可区分共洗脱组分(如杨梅素3-O-葡萄糖苷FPS-POS/NEG=-1.46)和分子量同分异构体(如Del 3-O-glu 5.96 vs 槲皮素3-O-glu -1.24)，并揭示花青素FPS-POS/NEG与结构的相关性：阿拉伯糖苷>葡萄糖苷/半乳糖苷，酰化产物比非酰化高2-4倍，且符合"羟基规则"—每增加一个OH基团比值降低，OCH₃取代则提高比值。

这项研究的意义在于建立了首个基于正负离子强度比的二维质谱分析范式，解决了花青素注释特异性不足的行业难题。FPS_P/N程序无需复杂前处理或特殊仪器改造，仅通过常规LC-MS数据即可实现前体离子精准判定，为功能性色素的高通量发现、植物代谢组学研究提供了可靠工具。特别值得注意的是，该方法揭示的FPS-POS/NEG与结构规律性关联，为今后预测未知花青素修饰类型开辟了新思路。正如作者Na Li和Jian-Lin Wu强调的，将Del 3-O-gal/glu的FPS-POS/NEG值作为阈值，可有效区分90%以上的花青素与黄酮类化合物，这对天然产物研究领域具有重要方法论价值。