基于流式细胞术的乳酸菌耐药性快速检测新方法

为解决传统乳酸菌(LAB)药敏检测耗时48小时的问题，研究人员开发了基于荧光D-氨基酸(FDAA)标记结合流式细胞术(FCST)的快速检测技术。通过优化探针浓度(0.15 mM)、暗孵育时间(3 h)和接种浓度(107 CFU/mL)，实现对5株假链双歧杆菌、1株植物乳杆菌和12株瑞士乳杆菌的12种抗生素MIC测定，与传统微量肉汤稀释法(BMD)结果一致性达95.14%(R2=0.92-0.99)。该方法将检测时间缩短至3小时，为食品工业和临床提供高效耐药监测工具。

　　

在食品工业和临床应用中，乳酸菌(LAB)作为重要的益生菌和发酵剂，其抗生素耐药性问题日益突出。传统微量肉汤稀释法(BMD)需要48小时才能获得结果，严重制约了耐药性监测效率。更棘手的是，乳酸菌可能成为耐药基因的储存库，通过基因水平转移威胁人类健康。世界卫生组织(WHO)已明确要求食品用乳酸菌不得携带耐药基因，但现有技术难以满足快速筛查需求。

针对这一技术瓶颈，中国某研究机构的研究人员创新性地将荧光D-氨基酸(FDAA)标记技术与流式细胞术(FCST)相结合，开发出可在3小时内完成检测的高通量方法。研究选取具有代表性的5株假链双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、1株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和12株瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)作为模型菌株，测试了包括氨苄青霉素、氯霉素等12种常见抗生素的敏感性。该成果发表在食品科技领域权威期刊《LWT》上，为微生物耐药性快速检测提供了新范式。

研究采用三大关键技术：首先通过FDAA特异性标记活菌细胞壁肽聚糖，利用其仅在代谢活跃细菌中整合的特性；其次优化流式细胞仪参数设置，建立前向散射(FSC)/侧向散射(SSC)双参数检测体系；最后开发标准化数据分析流程，以荧光强度变化判定最小抑菌浓度(MIC)。所有实验菌株均来自ATCC标准菌库和实验室保藏菌种。

【FDAA特异性与稳定性】
荧光显微成像证实FDAA仅标记活菌，死菌无信号。探针在暗处保存24小时荧光强度无衰减，满足实验稳定性要求。流式检测中通过未标记阴性对照和FDAA单标阳性对照精确定位细菌群，建立R1(细菌群)和R2(标记菌)双门控策略。

【FCST条件优化】
以万古霉素为模型药物，系统优化三个关键参数：暗孵育时间实验显示3小时结果与BMD法完全一致；FDAA浓度测试表明0.15 mM既能保证标记效率又避免毒性；细菌接种浓度确定为10⁷ CFU/mL，既保证检测灵敏度又避免抗生素效力被高菌量抵消。

【方法学验证】
对6株模式菌的12种抗生素检测显示，FCST与BMD结果高度一致。线性回归分析显示两者MIC值相关系数R²达0.92-0.99(P<0.001)。荧光显微镜观察证实，万古霉素在1 μg/mL、链霉素在8 μg/mL时FDAA标记强度显著降低，与流式结果相互印证。

【实际应用表现】
扩展检测12株临床分离株发现，瑞士乳杆菌对红霉素(MIC<0.016-0.063 μg/mL)、克林霉素(0.063-4 μg/mL)等普遍敏感，但对四环素、庆大霉素等呈现菌株特异性耐药。假链双歧杆菌对利福平、链霉素敏感，但对环丙沙星、氯霉素等普遍耐药。FCST与传统方法的一致性达到95.14%，仅少数案例存在1-2个稀释度的偏差。

这项研究突破了传统药敏检测的技术局限，将检测周期从48小时缩短至3小时，效率提升16倍。其创新性体现在三个方面：FDAA标记实现了细菌代谢状态的实时反映；流式细胞术提供高通量检测平台；标准化操作流程保证结果可靠性。该方法不仅可用于发酵食品生产的质量控制，指导合理使用抑菌剂，还能为临床益生菌制剂的安全性评价提供技术支撑。研究人员特别指出，该方法在结核分枝杆菌等慢生长菌的药敏检测中具有潜在应用价值，未来可通过优化探针组合进一步拓展检测范围。

这项技术的成功开发标志着微生物耐药性检测进入"快检时代"，为应对全球抗生素耐药危机提供了新的技术武器。正如作者Jie Yu和Shuxin Ren在文中所强调的，该方法的应用将显著提升食品工业和医疗领域对乳酸菌耐药性的监控能力，为相关产品的安全评估建立快速响应机制。随着技术的不断完善，这种基于流式细胞术的创新检测策略有望成为微生物药敏检测的新标准。