揭开糖尿病足溃疡氧化应激全景：基于RNA测序的深度机制解析与诊断新靶点

为解决糖尿病足溃疡(DFU)中氧化应激机制不清的问题，研究人员结合bulk RNA和单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据，开展系统性生物信息学分析，鉴定出BCL2和FOXP2作为诊断标记，揭示成纤维细胞在氧化应激中的核心作用及细胞间通讯网络。研究为DFU早期诊断和靶向治疗提供了新策略，发表于《Biology Direct》。

　　

糖尿病足溃疡（Diabetic Foot Ulcer, DFU）是全球糖尿病患者面临的严峻挑战，流行病学数据显示，约19-34%的糖尿病患者会发展为此病，其中20%面临截肢风险，一年死亡率高达10%。尽管氧化应激（oxidative stress）被确认为DFU发病的关键机制——过度产生的活性氧（ROS, Reactive Oxygen Species）破坏细胞稳态、引发炎症并阻碍伤口愈合——但其具体分子靶点、细胞类型和信号通路仍模糊不清。传统研究受限于技术手段，难以解析细胞异质性和复杂调控网络，亟需整合多组学方法深入探索。

针对这一空白，上海奉贤区中心医院的研究团队在《Biology Direct》发表了一项突破性研究。他们结合bulk RNA测序（RNA-seq）和单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，通过生物信息学分析和体外实验验证，首次系统描绘了DFU的氧化应激全景图。研究利用GEO数据库中的临床样本（包括GSE80178、GSE143735等数据集），应用差异表达分析、加权基因共表达网络分析（WGCNA）、机器学习算法（SVM-RFE、LASSO、RF）筛选关键基因；结合scRNA-seq数据（GSE165816）进行细胞聚类、氧化应激评分和细胞间通讯分析；并通过体外成纤维细胞模型（L929细胞）模拟DFU微环境，验证基因表达和功能。

Bulk RNA-seq分析揭示氧化应激相关基因

通过合并两个bulk RNA-seq数据集并消除批次效应，研究者筛选出1,033个差异表达基因（DEGs），其中33个上调、1,000个下调。结合WGCNA和GeneCards数据库中的氧化应激相关基因（OSRGs），鉴定出63个DFU特异性氧化应激基因（DORGs）。蛋白互作网络（PPI）分析显示，这些基因显著富集于氧化应激响应通路（如线粒体功能）和癌症相关通路（如前列腺癌），提示DORGs在DFU病理中的核心作用。药物预测还发现，Thymoquinone和Erlotinib可能靶向DORGs，具有治疗潜力。

机器学习识别诊断枢纽基因

采用三种机器学习算法（SVM-RFE、随机森林和LASSO）对63个DORGs进行筛选，交叉验证确定BCL2和FOXP2为诊断枢纽基因。两者在DFU样本中均显著下调，且与免疫细胞浸润相关：BCL2与CD8⁺ T细胞正相关，FOXP2与滤泡辅助T细胞关联紧密。转录因子- miRNA网络预测显示，BCL2和FOXP2受特定miRNA（如miR-181b）和转录因子（如FOXA2）调控，为机制研究提供方向。

免疫微环境特征

CIBERSORT分析揭示DFU病变中初始B细胞和CD8⁺ T细胞显著增多，且免疫细胞间存在复杂相关性（如NK细胞与巨噬细胞负相关）。这反映了DFU微环境的炎症状态，枢纽基因BCL2和FOXP2的异常表达可能通过调节免疫反应加剧病理进程。

单细胞层面解析氧化应激热点

scRNA-seq数据（31,787个细胞）聚类为10种细胞类型，包括平滑肌细胞、成纤维细胞（fibroblasts）、内皮细胞等。关键发现包括：

• 成纤维细胞比例下降：DFU组成纤维细胞占比（20.5%）显著低于对照组（28.53%），且BCL2和FOXP2表达一致性降低。
• 成纤维细胞氧化应激评分最高：基于OS_up基因集（如促氧化基因）评分，DFU成纤维细胞氧化应激水平显著升高；而OS_down基因集（如抗氧化基因）评分最低，证实其为氧化应激的核心靶细胞。
• 细胞间通讯主导胶原信号：CellChat分析显示，成纤维细胞作为主要信号发送者，通过COLLAGEN通路（配体如COL家族，受体如CD44）与平滑肌细胞、内皮细胞交互。这一网络在DFU中异常，可能阻碍伤口修复。

成纤维细胞亚群分化轨迹

进一步亚聚类将成纤维细胞分为5类：SFRP5⁺、MGP⁺、FAP⁺、CXCL1⁺和COL6A5⁺。DFU组以COL6A5⁺亚群为主（占比50.18%），其分化潜能最低；而高分化潜能的FAP⁺和CXCL1⁺亚群比例较低。伪时序分析（CytoTRACE和Monocle2）表明，成纤维细胞分化轨迹从FAP⁺起始，经中间状态终末化为COL6A5⁺，提示氧化应激导致成纤维细胞衰老和功能退化。

体外实验验证枢纽基因作用

通过L929成纤维细胞模型模拟DFU微环境（高糖33 mM Glu + H₂O₂ 25μM），研究发现：

• 氧化应激水平升高（DCFH-DA荧光检测证实ROS增加）。
• 细胞迁移能力显著下降（划痕实验显示愈合率降低），但无细胞死亡。
• BCL2和FOXP2在mRNA和蛋白水平均显著下调，与外部数据集（GSE199939）结果一致。

研究结论强调，BCL2和FOXP2作为氧化应激相关枢纽基因，不仅是DFU诊断的潜在生物标记物，还通过调控成纤维细胞功能影响伤口愈合。成纤维细胞在DFU中表现为氧化应激的“热点”细胞，其亚群失衡（COL6A5⁺主导）和分化潜能下降，是导致细胞数量减少和组织修复障碍的关键机制。此外，COLLAGEN信号网络的失调进一步加剧